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关于HIF1α 基因表达下调对人结肠癌SW480 细胞增殖和VEGF 表达的影响 【摘要】目的: 研究转录因子缺氧诱导因子1α （HIF 1α ）在缺氧条 件下对人结肠癌SW480 细胞增殖的作用，以及HIF 1α 对血管内皮生长因子 （VEGF)表达的影响，研究HIF 1α 调节SW480 细胞增殖的机制. 方法: 构建 针对HIF 1α 的pSuper EGFP siRNA 表达载体，转染SW480 细胞，抑制HIF 1α 的表达，RT PCR 和Western Blot 检测抑制结果；MTT 法检测HIF 1 α 被抑制后，SW480 在缺氧培养条件下的增殖情况；RT PCR 和Western Blot 检测 VEGF 的表达. 结果: 缺氧培养条件下，HIF  1α 和 VEGF 表达明显上升； 转染pSuper EGFP siRNA 表达载体后，SW480 细胞HIF 1α mRNA 和蛋白质 的表达大幅下降；SW480 细胞增殖下降（P0.05）； 而在缺氧培养条件下有较 高表达的VEGF，其mRNA 和蛋白质的表达也大幅下降. 结论: HIF1α 在缺氧 条件下，对SW480 细胞在增殖有影响，其机制可能是通过在缺氧时上调节VEGF 等细胞生长因子的表达，进而调节肿瘤细胞生长. 【关键词】缺氧诱导因子 血管内皮生长因子类 RNA 干扰 SW480 细胞增殖 0 引言 缺氧诱导因子1 (hypoxia inducible factor 1， HIF 1)是调节肿 瘤细胞缺氧反应的主要转录因子. HIF 1α 是决定HIF 1 活性的亚单位，其 在许多肿瘤中高表达，与肿瘤高度侵袭性、易转移、对放化疗不敏感和预后不 良密切相关［1］；同时HIF 1α 与肿瘤细胞增殖、细胞凋亡、糖代谢、血管 生成有紧密联系［2］. 以HIF 1α 为靶点的抗肿瘤治疗正成为许多基础和临 床研究的热点. RNA 干扰( RNA interference， RNAi) 是一种封闭基因表达的 有效方法. 为探讨以HIF 1α 在SW480 细胞增殖中的作用，及以HIF 1α 靶 点的RNA 干扰对结肠癌的作用， 我们构建了针对HIF 1α 的短发夹RNA （short hairpin RNA，shRNA）表达载体，抑制其表达，研究HIF 1α 表达 被抑制后，SW480 细胞增殖及其VEGF 表达的变化. 1 材料和方法 1.1 材料 脂质体LipofectamineTM 2000 购自Invitrogen 公司；兔抗HIF 1α 多 克隆抗体、VEGF 多克隆抗体购自Santa Cruz 公司，羊抗兔HRP 二抗购于北京 中杉金桥公司；逆转录试剂盒和T4 DNA 连接酶购自MBI 公司；Tag 聚合酶和 TRIZOL 试剂购自Gibco 公司；蛋白酶抑制Cocktail 购于Sigma 公司；PVDF 膜 购自Millipore 公司；ECL 试剂盒购于Pierce 公司；HIF 1α 靶shRNA 和无 义对照的DNA 寡核苷酸链和PCR 引物由博士德公司合成；pSUPER EGFP siRNA 表达载体由第三军医大学陈春霖博士赠送. SW480 细胞株由四川大学华西医院 肿瘤生物治疗研究室赠送. 1.2 方法 1.2.1 细胞常氧和缺氧培养 SW480 细胞在含100 mL/L 小牛血清的RPMI 1640 中培养（37℃，210 mL/L O2，740 mL/L N2，50 mL/L CO2）；低氧条件建立：将生长状态良好的SW480 细胞置于三气培养箱中低氧培养(10 mL/L O2，50 mL/L CO2，940 mL/L N2)， 模拟肿瘤组织缺氧微环境. 1.2.2 人HIF1α siRNA 表达载体的构建 根据文献［3］报道，合成构建人HIF 1α siRNA 表达载体的一对互补 19 nt 寡核苷酸链，两端带有Bgl II 和Hind III 酶切位点.siRNA 和无义对照 序列都在GenBank database 进行BLAST 检索，所设计的siRNA 序列仅仅与人 HIF 1α 序列相配，而无义寡核苷酸对照链顺序不与任何人基因序列相配. 将正义和反义寡核苷酸链各 1 nmol 在50 μ L 退火缓冲液中退火，退火程 序按95℃ 4 min，70℃ 10 min，缓慢冷却至室温，形成带酶切位点