第03章 污染物的生物效应检测2.pptVIP

第三章 污染物的生物效应检测 第三节 生物的分子和细胞水平检测 第四节 生物致突变、致畸和致癌效应检测 第五节 微宇宙法 第三节 生物的分子和细胞水平检测 污染物→生物的危害→行为改变、生理、生化反应→在分子和细胞水平上的检测 加合物 一般酶系（重要生理过程的） 解毒系统酶类诱导作用 抗氧化防御系统 一、加合物测定 DNA-加合物的测定 蛋白加合物 DNA-加合物的测定 DNA-加合物—化学物经生物转化后的亲电活性产物与DNA链特异位点上的共价结合物，加合物的位点多在N-7鸟嘌吟，O-6鸟嘌吟，N-1-或N-3-腺嘌吟。 DNA加合物测定方法 各种色谱法 免疫法 荧光法 32P-后标记法 免疫法 基本原理——抗原-抗体反应 根据应用技术可分为 放射免疫(RIA) 酶联免疫(ELISA) 超敏酶学放射免疫法(VS—ERISA) 免疫法的灵敏度可达到一个加合物∕107～108核苷酸水平，所需样品的DNA量为25～50μg。 荧光法 基本原理——通过某些化合物的DNA-加合物具荧光特性而进行定量。 常见的技术 同步荧光法 低温激光法 激光-发射荧光法。 荧光法的长处 不破坏DNA链 可区分出加合物的不同立体异构体 DNA链不同位点上的加合物 32P-后标记法（32P-postlabeling Assay） 基本原理——先将分离出的DNA用一定的酶水解成正常的单核苷酸和形成了加合物的单核苷酸，并进一步将二者分离，再用32P标记的ATP将带有加合物的单核苷酸标记，然后用双向层析、放射自显影、液闪计数等方法定量。 优点——检测能力强、应用范围广，可检测任何化学物与DNA的连接，尤其是可用于环境中生物样品的加合物测定以及判断化合物的毒性，包括纯品或混合物是否有潜在的致癌作用，同时具有极高的灵敏度，可检测到109个碱基中的一个DNA加合物。 蛋白加合物 外周血蛋白（血红蛋白、血清白蛋白） 血红蛋白（Hb，hemoglobin） 间接反映连接于DNA的加合物 动物实验中已发现有50多种化学物质可与Hb反应，致突变物及致癌物均可与Hb连接 Hb-加合物最常用的测定方法 色谱-质谱(GC-MS，gas chromatography-mass spectroscopy)法 免疫法检测 灵敏度因化学物质和选用方法不同而异 Hb的生存期在120天左右 其加合物可作为中长期暴露的指标 二、一般代谢酶的活性测定 特定反应中的关键酶的变化→证实污染物的影响 酶指标 生物受到亚致死剂量毒物的暴露时 酶指标来对毒物进行生化水平上的评价 探讨毒物的作用机制 乙酰胆碱酯酶 腺三磷酶（ATPase） 乙酰胆碱酯酶 乙酰胆碱酯酶（AChE）一个很经典的毒理指标 由于有机磷农药能抑制AChE的活性，所以AChE可作为有机磷农药污染的指标。 20%以上AchE活性抑制—暴露作用存在； 50%以上AchE活性抑制—对生物的生存有危害。 最常用的测定方法——比色法 胆碱酯酶水解乙酰胆碱的硫醇化合物→硫醇＋双二硫代硝基苯甲酸（DTNB）→深黄色结合物——412nm波长检测； 与未水解的乙酰胆碱底物→棕色异羟亏酸铁的铬合物——540nm； 放射测量法： 乙酰-1-C14胆碱作底物→去除未水解底物→乙酰-1-C14计数测量 其他——测压法、荧光法和电化学法 腺三磷酶（ATPase） 功能：水解ATP 方法：钼蓝法——经酶水解释放的无机磷 酶活性——毫微摩尔无机磷∕毫克蛋白∕小时 三、解毒系统酶类诱导作用的检测 混合功能氧化酶的诱导作用 MFO特异性不强，多种方法可以测定。 直接法 直接测定各组成成分，P-450等的含量。 代谢法 测定MFO催化反应的底物消耗量和产物生成量。 多种方法检测，综合评定MFO的作用。 谷胱甘肽硫转移酶 谷胱甘肽硫转移酶（glutathione-S-transferase GST）分布广泛。 哺乳动物中肝的可溶部分中GST的浓度最高。 四、抗氧化防御系统检测 过氧化氢酶（CAT） 谷胱甘肽过氧化酶（GPx） 过氧化氢酶（CAT） CAT的重要作用 环境污染物对CAT活性的影响 CAT活性测定方法 测量由H2O2分解所释放出的氧，在240nm波长测定过氧化氢的吸光度； 电化学法测量过氧化氢； 容量法滴定剩余的过氧化氢等方法。 谷胱甘肽过氧化酶（GPx）1 该酶于1957年被米尔斯（Mills）从牛红细胞中发现。 GPx主要生物学作用 清除脂类过氧化物； 可代替过氧化氢酶清除H2O2； 可防止畸变，预防衰老。 谷胱甘肽过氧化酶（GPx）2 测定GPx活力有两种常用方法。 直接法，即直接测定GSH减少量，这是1959年米尔斯（Mills）首次提纯GPx时所用的方法之一。 原理—GSH在255 nm处呈最大吸收，故可从255