2.1基因操作技术.pptVIP

第二章 DNA重组技术与基因操作 §2·2 限制性内切酶（Restriction Endonuclease, RE） 作业：现有一长度为12kb的DNA片段，用EcoR I完全酶解，产生3kb、4kb、5kb三种片段；用Hind III 完全酶解，产生2kb、4kb、6kb三种片段；最后用两种酶完全酶解，产生1kb、2kb、3kb、4kb四种片段。请绘出葡聚糖凝胶电泳结果，并确定这段DNA片段的内切酶图谱。 §2·3 克隆载体（cloning vector） §2·3·1 质粒载体（Plasmid vector） §2·3·2 入-噬菌体载体（入-phage vector） §2·3·4 丝状噬菌体载体——M13 一、M13噬菌体结构与生活史 具有丝状的蛋白质外壳，其基因为单链正链DNA（＋ssDNA） 二、改造成载体 M13 基因组有6.5kb，其中有507nt可以被外源DNA所更替。 作为载体的优点： ? 被复制，最终释放出的重组M13噬菌体的基因为＋ssDNA ? 可用作模板进行序列分析； ? 还可用于制备单链探针。 §2·3·5 酵母人工染色体（YAC） 一、酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosome, YAC）的基本构成： ?着丝粒（centromere, CEN）— 保证姊妹染色体在有丝分裂时被正确地分配到各子细胞。 ?端粒（telomere , TEL）— 位于染色体末端，可防止染色体被核酸酶切割掉。 ?自主复制序列（automatic replication sequence , ARS）— 即真核生物染色体的复制起始点。 ? 筛选标记— 一些抗性基因或一些必需的合成酶基因 TEL 目的基因 ARS CEN 筛选标记 TEL 二、YAC的优缺点 YAC的优点：可容纳1000kb以上的外源DNA片段， ?一来可以保证基因结构的完整性； ?二来可以大大地减少核基因库中所需的克隆数 缺点：插入的外源DNA片段重组率高。 §2·4 原核细胞的转化与筛选 一、转化（Transformation） 所谓的转化，是指将质粒、噬菌体DNA或以它们为载体构建的重组体导入宿主细胞，从而使宿主细胞获得新表型的过程。 ?其中，宿主是指受体细胞，也是重组体复制和表达的场所，为了保证重组体DNA不被分解，宿主细胞一般为限制性内切酶缺陷型，又称重组缺陷型（RecA-）。 §2·5 原核生物基因组文库的构建与筛选 一、概念 基因组（genome），又称基因组DNA，是指一生物体所含的全部DNA。 基因组文库（genomic library），包含有该基因组全部DNA的克隆组，其中一个克隆是含有该基因组的一个小片段的重组子的宿主细胞。 §2·5 原核生物基因组文库的构建与筛选 二、基因组文库的构建 §2·6 获得真核生物目的基因的方法 四、入-噬菌体的基因组成 用BamH I切，可将入-phage DNA 分成3部分： L region 1/E R region 20kb 18kb 12kb 编码外壳蛋白 编码有关整合、 编码与DNA复制、 切割的酶 细胞裂解的酶 ● 五、入-phage vector 的构建 一般用外源目的基因来取代1/E部分，可见该载体所能容纳的外源目的基因的大小为：15～20kb。 ★ 注意：对入-phage vector 的大小要控制在38kb～52kb之间，才具有侵染力。 §2·3·3 柯斯质粒（cosmid） 是由Collins Hohn 于1978年构建出来的——利用入-phage DNA的cos区克隆到一般质粒，如pBR322上， 总长度为4～6kb，这样该载体可携带的外源基因可达40到50kb。 ★特点： ①具有抗药性和复制起始点（源于质粒载体）； ②具有MCS； ③带有cos位点，只有两个cos位点之间的DNA序列长度为野生型入-DNA大小的75％～105％时，才能被包装成具有侵染