基因工程-提取DNA.pptVIP

基因工程需要三种不同的DNA: 总DNA 质粒DNA 噬菌体DNA 1.1培养、收集细菌细胞 两种类型的细菌培养基的成分： M9培养基： Na2HPO4(6.0) KH2PO4(3.0) NaCl(0.5) NH4Cl(1.0) MgSO4(0.5) Glucose(2.0) CaCl2(0.015) LB培养基： typtone(10) Yeast extract(5) NaCl(10) 1.1培养、收集细菌细胞 1.4 DNA的浓缩与浓度测定 最常用的方法是乙醇（同时含有Na离子）、异丙醇沉淀法。 260nm下测定吸光度，1OD相当于50μg双链DNA/ml。A260/A280=1.8，1.8 表示含有酚或蛋白质, 1.8说明有RNA。 2 质粒DNA提取 质粒DNA的大小（ 8%）。 DNA的构造 ◇ Alkaline denaturation ◇ Ethidium bromide-caesium chloride density gradient centrifugation 温和裂解细胞可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整。 问题： 裂解液中包含染色体DNA 质粒分子非常大时 ，将与染色体DNA共沉淀 碱裂解法 基本原理：在pH12.0~12.5范围内，非螺旋化的DNA会变性，而闭合环状的质粒的DNA则不会被变性或只有少量的氢键断裂；当恢复中性pH值时便会迅速地复性。但变性的线性染色体DNA分子复性时不准确，也不迅速，因此彼此聚集形成网状结构，通过离心分离便与变性的蛋白质及RNA一起沉淀下来，而仍滞留在上清液中的质粒DNA则可用酒精等沉淀收集。 EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA结合EB浮力密度降低较小，仅有0.085g/cm3。 2.3 质粒扩增 一些多拷贝质粒具有在无蛋白合成条件下复制的能力。 加入蛋白合成抑制剂如氯霉素，可以获得上千个拷贝。 3 噬菌体DNA的制备 当培养物离心时，细菌沉淀到底部，噬菌体留在悬浮液中，去蛋白就可以获得噬菌体DNA。  每ml菌液可以获得1010λ噬菌体，但只能产生500ngDNA。 3.1 噬菌体的培养 cI突变的温度敏感突变体。 3 噬菌体DNA的制备 3.2 收集噬菌体 噬菌体颗粒非常小，需高速离心沉淀。 PEG可使病毒颗粒形成多聚体。较低离心力即可沉淀λ噬菌体。 3 噬菌体DNA的制备 3.3 从λ噬菌体中纯化DNA PEG沉淀物中可能含有少量的细菌裂解物，也可能含有细菌DNA。 可通过CsCl梯度离心去掉。 通过酚抽提或者蛋白酶处理蛋白质外壳。 4 纯化M13 DNA  每ml菌液可以获得1012的噬菌体。少量的培养物可以获得大量的噬菌体。 细菌细胞不裂解，不存在细胞裂解物的问题，也不需要CsCl梯度离心。 思考题 DNA提取的一般步骤 DNA浓缩、纯化的方法 测定DNA浓度和纯度的方法 Pr, DNA, RNA在CsCl梯度离心中分布 质粒DNA的结构有哪几种？提取方法及其原理 Phage DNA的提取方法 The lysogenic infection cycle of bacteriophage λ Figure3.17 Induction of a λ clts lysogen by transferring from 30 ℃ to 42℃ Lysogenic λ phage At 30 ℃, clts gene protein works, Keep lysogeny: At 42 ℃, clts gene protein does not work, produce extracellular phage. Figure3.18 Achieving the right balance between culture age and inoculum size when preparing a sample of a non-lysogenic phage Non-lysogenic λ phage（Lytic) 由于缺失修饰，大多数基因工程载体属于此类型。 Figure3.19 Collection of phage particles by polyethylene glycol(PEG) precipitation Collection of phage particles Purification of λ phage Figure3.20 Purification of λ phage parti