细胞工程-实验前准备2yhy.pptVIP

细胞工程Cell Engineering 第一节： 动物细胞实验前准备2 清洗 消毒灭菌（sterilization） 无菌操作 从事细胞培养工作，最基本也是最关键的要求是：无菌操作，防止污染。 污染源：微生物污染和化学污染 微生物污染： 细菌 真菌（酵母菌和霉菌） 支原体 病毒 污染源广泛存在于空气中、实验材料上、实验器皿器械上、培养用液中等。 微生物污染是细胞培养工作失败的重要原因之一 微生物的生存能力远大于培养的动植物细胞，争夺培养细胞的营养物质，改变培养细胞的体外生存环境如pH，导致细胞培养失败。 动物细胞培养的清洗要求 玻璃培养器皿的洗涤 1、常规洗涤?先洗涤油污、石蜡、胶布等物。?洗洁精中洗涤，直至瓶壁上不挂水珠为止 ?自来水冲洗，去除洗洁精。必要的话重复? ?蒸馏水淋洗器具的内外壁?倒置晾干，或烘干、热风吹干。?放置在专用橱柜中备用。 实验所用培养器皿清洗及消毒 培养有关器皿 培养瓶，多由玻璃或塑料制成，主要用于培养或繁殖细胞。进行培养时培养瓶口家培养瓶盖或旋转橡胶塞。国产培养瓶以容量(mL)表示,进口培养瓶多以底面积（cm2）表示； 培养皿：玻璃或塑料制成，供盛取、分离、处理组织或做细胞毒性、集落生成、单细胞分离，同位素参入、细胞繁殖等用，常用的培养皿规格有10cm，9cm，6cm，3.5cm等。 多空培养板：为塑料制品，可供细胞克隆及细胞株毒性等各种检测试验使用，可有效节约样本及试剂，可测试大量样本，易于进行无菌操作。培养板分为各种规格，常用的有96孔，24孔，12孔，6孔，4孔等。 培养操作有关仪器 贮液瓶：主要用于存放或配制各种培养用液体，如培养液，血清及试剂等。储液瓶分为不同规格，如1000ml，500ml，250ml，100ml，50ml，5ml等 吸管：主要分为刻度吸管和无刻度吸管，主要用于吸取、转移液体及吹打，混匀及传代细胞。 加样器：用于吸取，移动液体或滴加样本，可根据需要调节量程。 金属器械：主要用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件; 手术刀（解剖刀）、手术剪（解剖剪）、眼科虹膜小剪（将组织剪成小块），血管钳及组织镊（持取物品），口腔探针或代用品（放置原代培养的组织小块） 杂用品：金属饭盒、试管架、橡胶塞、记号笔、搪瓷盘、枪头、橡胶塞、酒精灯、酒精、棉球等。 一般而言，实验准备时杂物要多于实验所需，枪头数要多于实验所用的数量，橡胶塞（瓶盖）要多于瓶数。 物理性清洗 超声波清洗适用范围：清洗消毒精细仪器。限制：单独使用无效。 洗涤适用范围：手、皮肤、物品等。限制：清洁，减少微生物量。 清洗方法 玻璃培养器皿的洗涤 1、特殊洗涤较脏的器皿：先用碱洗，晾干后浸入洗液，可浸几分钟到几天不等，然后取出，滴干洗液。 新的未使用过的玻璃器皿，应先泡一下洗液。 ?自来水冲净洗。?蒸馏水淋洗器具的内外壁?倒置晾干，或烘干、热风吹干。?放置在专用橱柜中备用。 玻璃器皿的清洗 1.浸泡: 新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5％盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。 2.刷洗: 将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。 3.浸酸 :浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于六小时，一般过夜或更长。放取器皿要小心。 4.冲洗: 刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包装备用。  洗液配方 洗液的配制方法： 弱液：KCrO4 50g + dH2O 1000 mL加热溶解，冷却后，缓缓加入工业用硫酸100mL。 次强液： KCrO4 100g + dH2O 200mL加热溶解，冷却后，缓缓加入浓硫酸200mL。 饱和液： KCrO4 10g + dH2O 20 mL加热溶解，冷却后，缓缓加入浓硫酸，并同时加入研碎的KCrO4 ，直到过饱和为止。比例一般为1000 mL浓硫酸加入KCrO4 50g。 洗液配制时要注意的几点！！！ 1、 KCrO4液要冷却后才能加浓硫酸。以防暴沸。 2、浓硫