分子生物学技术在消化道微生物研究中的应用.pptVIP

分子生物学技术在消化道微生物多样性研究中的应用 张老师 肠道微生物的构成 动物肠道内存在着复杂、多样微生物。 细菌 真菌 原虫 噬菌体等 肠道微生物的传统研究方法及其局限性 培养技术 能培养的微生物只是天然微生物中的一小部分，一些微生物不能用现有的技术培养，因此，微生物的多样性被严重低估。 表现型不足以明确分类。因为不同的生理特征或许掩饰了遗传相似性；而相似的生理特征和形态或许掩盖了微生物遗传多样性。 现代分子生物学技术研究肠道微生物多样性 分子生物学技术弥补了传统的微生物培养技术的不足，为现代微生物资源的研究与开发开辟了新天地。 基于16S rRNA为靶标基因的PCR技术。 培养技术与分子生物学技术结合。 16S rRNA的序列分析技术 基本原理：就是利用微生物样本中的16S rRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16S rRNA序列信息，再与16S rRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。 主要包括3个步骤： 微生物样品基因组DNA的提取； 16S rRNA基因片段的获得； 16S rRNA基因片段的分析. 16S rRNA基因片段的获得(PCR扩增) 用16SrRNA通用引物进行PCR扩增的一般程序如下: 94~96℃预变性2~5min； 94~95℃变性30~60 s；45~55℃退火60 s； 68~72℃延伸2~4 min；最后68~72℃延伸6~10 min。 采用PCR技术的优点在于一次性从混合DNA或RNA样品中扩增出16S rRNA序列。 缺点：可能出现嵌合产物和扩增偏嗜性现象。 16S rRNA基因片段的分析方法 16S rRNA基因序列的测定与16S rRNA基因文库的构建。　 16S rRNA基因片段的多态性分析（ DNA遗传指纹图谱技术）。 通过16S rRNA种属特异性的探针与PCR产物杂交以获得微生物组成信息。 对PCR产物进行限制性片段长度多态性分析或末端限制性片段长度多态性分析。 16S rRNA基因序列的测定与16S rRNA基因文库的构建 对单一模板，细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增得到的PCR产物可以直接测序；也可以将PCR产物用琼脂糖电泳回收目的片段，再将目的片段测序。 目前最常用也最有效的方法是将PCR产物用琼脂糖电泳回收目的片段，将目的片段克隆进质粒载体，再转化大肠杆菌，筛选含有目的基因的转化子，测序，此法同时可以构建一个肠道微生物16S rRNA基因文库长期保存。 对混合的肠道微生物， PCR产物需经过聚丙烯酰胺凝胶分离，获得单一的条带后再回收DNA，克隆、转化、测序。 使用BLAST 在GenBank或核糖体数据工程(RDP)进行搜索和相似性比对. DNA遗传指纹图谱技术 变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel elctrophoresis， DGGE) 温度梯度凝胶电泳(Temperature gradient gel elctrophoresis，TGGE)、 限制性片段长度多态性分析(Restriction fragment length polymorphism，RFLP) 其中DGGE指纹技术发展迅速 变性梯度凝胶电泳(DGGE) 原理是:在碱基序列上存在差异的不同DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度，DNA双链一旦解链，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降；因此，将PCR扩增得到的等长的DNA片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳，序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。 每个条带代表一个特定序列的DNA片段。在不同泳道中停留在相同位置的条带，一般可视为具有相同的DNA序列。 变性梯度凝胶电泳 基因探针杂交技术 基因探针是一段特异性的DNA单链(通常长度为15到30个碱基)，可根据碱基互补的原理与待测样品中的互补序列在特定条件下结合。 杂交后就可利用与目标基因结合的基因探针上的放射性信号或荧光信号识别样品中的目标核酸。 探针的长度与检测结果可靠性关系非常大。 核酸印迹杂交 在16S rDNA/RNA技术中用到的是RNA印迹杂交.RNA印迹杂交可以用来定量检测特定微生物种群16S rRNA在总rRNA中的比例. 近年来，核酸印迹杂交技术的集成化使得基因芯片技术应运而生. 荧光原位杂交 将基因探针用荧光染料标记，再使之与固定在载玻片上的微生物样品杂交，将未杂交的荧光探针洗去后用普通荧光显微镜或是共聚焦激光扫描显微镜进行观察固定的细胞。 由于杂交的是整个细胞，省去了提