猪心肌肌球蛋白分离纯化.docVIP

猪心肌肌球蛋白的分离纯化 　　摘要:本文建立了一种简便、快速的提纯方法,从猪心肌中分离纯化得到肌球蛋白。实验结果表明,通过超速离心和硫酸铵分级盐析,主要杂蛋白被除去。所得蛋白经SDS、HPLC和XRD图谱分析,说明提纯的肌球蛋白达电泳纯,并有结晶特征。测定其比活力为0.293U/mg,活力得率42.1%,纯化倍数4.9。本法具有成本低,纯度高,酶活良好的特点,结果满意。 　　关键词:心肌肌球蛋白;分离纯化;硫酸铵盐析 　　中图分类号:Q512.2 文献标识码:A 　　 　　心肌肌球蛋白(cardiac myosin,CM)分子量约520KDa,由两条重链(MHC,220 KDa)和两对轻链(MLC1,27KDa;MLC2,20KDa)组成[1]。CM具有ATP酶活性,是心肌的主要结构和收缩蛋白。心肌收缩能力受多种因素的影响,兴奋收缩耦联的各个环节都能影响收缩力,其中肌球蛋白ATP酶活性是控制收缩能力的主要因素。 　　研究表明,CM结构或功能的改变与心室功能障碍、心力衰竭和心律失常等心肌病变有直接关系[2,3]。因此,从心肌组织中有效分离纯化CM,是在分子水平上,深入研究心肌病变的发病机理和预防措施的重要前提。目前提取纯化CM都是利用肌球蛋白在高离子强度下可溶,而在低离子强度下不溶的性质进行的,但大多操作繁琐,成本高,蛋白收率低或ATP酶活损失大[4-11],因此,寻找更佳的CM提纯方法具有重要意义。 　　本文对提纯方法进行了部分改进,从猪心肌提取了CM,建立了CM的纯化方案。此方案仅需简单的超速离心、硫酸铵分级盐析操作,即可达到纯化要求,且所用材料均为实验室常规用材,费用低廉,可广泛应用于实验室操作及临床研究。 　　 　　1 实验部分? 　　 　　1.1 仪器、材料与试剂? 　　1.1.1 主要仪器 　　CP100MX超速冷冻离心机(HITACHI, 日本),Centrifuge5417R 台式冷冻离心机(eppendorf, 德国),Ultra Freeze 5410超低温冰箱(HETO公司,捷克),CR22G高速冷冻离心机(HITACHI, 日本),DY-Ⅲ垂直平板电泳成套设备(北京六一仪器厂),GeneGenius GeneGnome凝胶成像系统(SYNOPTICS LTD, 英国),MAXI-DRY LYO真空浓缩(冻干)系统(HETO公司,捷克),L-7000高效液相色谱仪(L-7455 DAD 检测器,L-7300柱温箱,L-7100四元梯度泵,D-7000 HPLC 系统工作站软件包。HITACHI,日本),C18柱(江苏汉帮科技有限公司),D8-Advance Powder X-射线粉末衍射仪(Bruker公司,德国),HH-4 恒温水浴锅(金坛市科兴仪器厂), FK-A 组织捣碎机(江苏金坛佳美仪器公司), pHS-25酸度计(上海伟业仪器厂),磁力加热搅拌器(江苏省金坛医疗仪器厂)。? 　　1.1.2 材料与试剂 　　新鲜猪心(冰生理盐水洗净后-70℃冰箱保存);低分子量Marker蛋白(上海基康生物技术有限公司);牛血清白蛋白(BSA, 分子量68 000, 电泳纯, Sigma公司); Na2ATP(AR Sigma公司);β-巯基乙醇(AR Amresco 公司);SDS(AR Sigma公司);丙烯酰胺(AR 广州维佳科技公司, 日本分装);N, N-甲叉二甲基双丙烯酰胺(AR 瑞士进口分装);硫酸铵(AR Sigma公司);N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED, AR 上海润洁有限公司, 生化试剂);考马斯亮蓝R-250、G-250(AR Amresco 公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris, AR Sigma公司);其它试剂均为国产分析纯,实验用水为超纯水。? 　　1.2 实验方法? 　　1.2.1 CM的提取及纯化 　　4℃下操作。pH7.4的Tris-HCl缓冲液中均含有0.001 mol#8226;L-1EDTA,0.01 mol#8226;L-1NaPPi,0.002 mol#8226;L-1β-巯基乙醇和0.005 mol#8226;L-1MgCl2。? 　　1.2.1.1 CM粗提液的制备 　　取猪心左心室适量,剪成小块后加入400 mL 0.05 mol#8226;L-1磷酸缓冲液(pH=6.8)匀浆,3600 rpm离心10 min,反复4次,弃上清。沉淀溶于适量0.01 mol#8226;L-1 Tris-HCl缓冲液(含0.5 mol#8226;L-1KCl),离心,上清即为CM粗提液。? 　　1.2.1.2 低盐析出,浓盐溶解 　　上清中加入9倍体积超纯水,调节溶液pH至5.4,缓慢搅拌3 h后10000 rpm离心10 m