dlc1基因对结肠癌ht29细胞生物学行为的影响及其分子机制的研究word格式论文.docxVIP

东南大学学位论文独创性声明本人声明所里交的学位论文是我个人在导师指辱下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名:系将均日期:P-0)0...怜...，)东南大学学位论文使用授极声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆布权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布(包括以电子信息形式刊登)论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布(包括以电子信息形式刊登〉授权东南大学研究生院办理。研究生签名:立协导师签名:勃日期:应1PlI/r目录中文摘要……*…………….??.?????. 1英文摘要 11……………..11. 11…….N缩略词表………11…….11.……?????..?.?.1前言文献综述 *3第一部分DLC-l基因对HT29细胞生物学行为的影响1材料与方法*…………………………202实验结果…………………………………………363讨论…………………42第二部分DLC-l基因调控H丁29细胞增殖侵袭的分子机制1 材料与方法… 462 实验结果………………………………·……………493讨论……………………·……………55第三部分DLC斗基因阳10GAP结构域对HT29细胞生物学行为的影响1 材料与方法...… .…592 实验结果...……… ..…… ..…….603 讨论.… .…64结论与展望11 ………………… 67参考文献……………… .…………… .…68作者简介………………………………..…… 78致谢…...…… ..… .…… 80中文摘要DLC-l基因对结肠癌HT29细胞生物学行为的影响及其分子机制的研究中文摘要i背景与目的l肝癌缺失基因-1 (齿叫uently deleted in liver cancer，DLC-l) 基因，位于人类染色体8p21.3-22，是…个新的候选抑癌基因。1998年Yuan等首先从原发性肝癌组织中分离出来，并认为该基因改变是肝癌发生的早期事件之一。随后，人们发现DLC-l在大多数肿瘤中表达下降或缺失，体内外实验也证明DLC斗基因可抑制多种肿瘤细胞生长和致瘤性。本课题组应用RNAi技术成功下调DLC-l阳性结肠癌LoVo细胞的DLC斗mRNA表达，结果显示该基因可促进Lo Vo细胞的增殖及侵袭，影响细胞周期建新分布。但其作用机制尚不清晰。有研究表明，DLC-l基囚的阳oQAP(阳10GTP脑，eactivatingprotein，则lOGAP) 结构城可能是其抗肿瘤作用的主要机制问。因此本研究在前期工作基础上，拟应用脂质体转染技术使DLC-l 阴性表达的HT29 结肠癌细胞株恢复表达，问时亦将阳10GAP(阳10GTPaseactivatingprotein)结构城缺失的eDLC-l亚克降序列转染至HT29细胞，以进一步探讨DLC-l基因在大肠癌中的生物学作用及其分子机制。I方法11.RT-PCR，Westernblotting检测三株大肠癌HT29、LVoo、CaCo-2细胞中DLC斗基因的表达。2. 构建DLC-l基因意组质粒pcDNA3.1-DLCl 以及即10GAP结构域敲除的eDLC-l基因亚克隆重组质粒pcDNA3.l?eDLCl?3.脂质体介导将pcDNA3.l心LCl和pcDNA3.1-eDLCl重组质粒分别转染结肠癌H下29细胞，并通过PCR电泳、双隅切(Xba1，BamH1)实验结果和测序进行鉴定。4. Rock 激酶(阳lo-associated kin邸e，ROCK) 激动剂Angiotensin 日，ROCK 抑制剂Y27632 分别处理细胞。5.MTT、平版克降实验、Transwell 侵袭实验、流式细胞仪技术分别检测细胞生物学行为改变。东南大学博士学位论文谷脱甘肤瑞基转移酶(Gluta伽ione S-trans岛rase，GST)Pull-down 技术分析则loA 蛋白活性。RealtimePCR 和Westemblo忧ing检测p2l、cyclinDl 的表达。Westemblotting检测ROCK、Erk激酶活性。I结果l1.首先筛选出DLC-l阴性表达的HT29结肠癌细胞株，而CaCo-2和Lo