dlk1dio3基因簇长非编码rn a在小鼠早期胚胎的表达及甲基化研究word格式论文.docxVIP

ClassifiedIndex:Q71U.D.C: 577.21DissertationfortheMasterDegreeinScienceEXPRESSIONPROFILEANDMETHYLATION STATUSOFLNCRNAINDLK1-DIO3REGION DURINGMOUSEPREIMPLANTATION DEVELOPMENTCandidate：TianYijunSupervisor：AssociateProf.GuNingAcademicDegreeAppliedfor：MasterofScienceSpeciality：BiologyAffiliation：SchoolofLifeScienceandTechnologyDateofDefence：June,2013Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology摘要Dlk1-Dio3基因簇非编码RNA，特别是长非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)的高水平表达对于诱导多能干细胞(inducedpluripotentstem,iPS)的全能性尤为重要。本研究选取此基因簇上3个重要lncRNAs(Gtl2、Rian和Mirg)，通过原位杂交(ISH)和荧光原位杂交(FISH)技术对其在早期胚胎中的表达和亚细胞定位进行研究，通过亚硫酸氢盐测序分析两个主要的差异甲基化区(IG-DMR、Gtl2-DMR)在早期胚胎中的甲基化水平，另外通过甲基转移酶抑制药物5zaz-CdR处理TM3细胞体外分析lncRNAs的表达变化，以明确此基因簇lncRNAs在发育中的时空表达模式和表观调控机制，为进一步研究lncRNAs功能奠定基础。本研究首先建立了基于孔板和液滴操作的全胚胎原位杂交方法。其他实验结果如下：ISH结果显示，在发育的早期阶段（卵母细胞、1-细胞、2-细胞、4-8细胞期）检测不到Gtl2、Rian和Mirg的表达，而到桑椹胚阶段这些lncRNAs开始表达，并在囊胚期表达量更高，这3个lncRNAs的表达模式非常一致（这与本实验室通过qRT-PCR得到的结果一致）；lncRNAs在囊胚都定位于内细胞团，而在滋养层中没有表达；FISH结果也进一步确认这3个lncRNAs在内细胞中的表达，而且在囊胚定位于细胞核外周。甲基化分析结果显示，在整个早期胚胎发育中，IG-DMR序列始终呈现父本染色体甲基化、母本染色体非甲基化状态，而Gtl2-DMR在父、母本染色体上都呈现非甲基化状态。体外5-aza-CdR处理TM3细胞，发现lncRNA的表达不受差异甲基化区甲基化调控。本研究首次明确了Dlk1-Dio3基因簇重要lncRNAs在小鼠早期胚胎发育过程的时空表达模式以及囊胚亚细胞定位，提示这些lncRNAs可能与胚胎干细胞的形成和维持存在内在联系，首次分析了IG-DMR、Gtl2-DMR在早期胚胎的甲基化模式，暗示DMR对lncRNAs的起始表达没有调控作用，而这两个DMR更可能是维持lncRNAs印记表达的主要因素。关键词：着床前发育；长非编码RNA；Dlk1-Dio3基因簇；DNA甲基化；全胚胎原位杂交；荧光原位杂交AbstractRecentyears,longnon-codingRNA(lncRNA)inDlk1-Dio3geneclusterhavegainedwidespreadattentionbecauseoftheircloselyrelationshipwithinducedpluripotentstem cell(iPS).Thisstudyfocusedon the mainlncRNAs(Gtl2,RianandMirg)inDlk1-Dio3genecluster,andanalyzedtheirsspatiotemporalexpressionpatternsbyinsituhybridizationandfluorescenceinsituhybridization(FISH).andthemethylationstatusoftwoimportantdifferentiallymethylatedregions(IG-DMR,Gtl2-DMR)weredetectedbybisulfitegenomicsequencingduringmousepreimplantationdevelopment.Additionally,varietyexpressionoflncRNAsandmethylationdynamicofDMRsinTM3treatedwithmethyltransferaseinhibitorwerealso analyzed.First