dotapdope 壳聚糖作为基因载体的应用研究word格式论文.docxVIP

摘要阳离子脂质体作为非病毒载体已经在体内、外实验中广泛用来递送报告基因和 治疗基因。壳聚糖是一种天然的阳离子多糖，它能够将 DNA 紧密的压缩形成聚电解 质复合物，同时保护基因不被酶降解。在上述基础上，研究了运用壳聚糖作为压缩 基团来提高阳离子脂质体介导的基因传递。在本论文中考察了两种载体同 DNA 的结 合和解离动力学，制备了脂质体/壳聚糖/DNA 复合物，并对其进行了表征，同时还 对其介导的基因转染进行了研究。主要工作如下：1.应用荧光停流技术研究 1,2 一二油烯氧基 3 一三甲氨基丙烷（1，2-dioleoyl-3- trimethy- lammonium-propane（chloride salt），DOTAP）和二油酰基磷脂酰乙醇 胺(1，2- Dioleyl-s –Glycero-3- Phosphoeth anolamine，DOPE)形成的阳离子脂质 体与质粒 DNA 及壳聚糖与质粒 DNA 的结合及解离动力学过程。结果表明 DNA 压缩是复合物形成过程中的限速步骤，而 DNA 的伸展及重排是复合物解离过程 中的限速率步骤。氮磷比（N/P）未达到热稳定状态时所形成的复合物是松散易 解离的。壳聚糖与 DNA 的结合能力较 DOTAP/DOPE 阳离子脂质体强。 2.用薄膜超声法制备了 DOTAP/DOPE 阳离子脂质体，并与壳聚糖和 DNA 形成 三元复合物（LCD），通过琼脂糖凝胶电泳、荧光置换、粒径和 Zeta 电位测试表 征了复合物的形成。结果表明质粒 DNA 经壳聚糖压缩后形成了粒径均一，分散 均匀的球型颗粒。其粒径较单纯的 DOTAP/DOPE-DNA 复合物小，Zeta 电位均 为正值且随 N/P 的增加略有升高。由于壳聚糖对 DNA 的压缩作用，脂质体在 DNA 外形成一层致密的包裹层，使溴化乙啶分子无法透过，因而不能插入 DNA 分子对其染色，复合物中的 DNA 全部被阻滞，随 N/P 的增加表现为加样孔的亮 度减弱。荧光置换实验表明随壳聚糖用量的增加，载体与 DNA 的结合能力逐渐 增强。3.通过人肝癌细胞 HepG2 和小鼠成纤维细胞 NIH3T3 考察了 DOTAP/DOPE 阳离 子脂质体/壳聚糖/DNA 三元复合物的毒性，研究了其体内体外的转染效率。结果 表明此复合物几乎无毒性，一定程度上还提高了细胞的存活率。加入壳聚糖抑制了血清对阳离子脂质体-DNA 复合物的破坏且提高了转染效率。无论是体内还是体外实验都表明此复合物的转染效率较裸 DNA 和单纯阳离子脂质体高。 综上所述，DOTAP/DOPE 和壳聚糖都能有效压缩 DNA，形成的复合物在一定范围内都可以解离。运用壳聚糖作为压缩基团不仅可以降低阳离子脂质体-DNA 复合物 的毒性，还可以提高其转染效率。关键词：DOTAP/DOPE；阳离子脂质体；壳聚糖；LCD；DNA；停流动力学；转染AbstractCationic liposome has been extensively used as a non-viral vector for the delivery of reporter and therapeutic genes in vitro and in vivo. Chitosan is a natural cationic polysaccharide, which can condense DNA and protect it against nuclease degradation. Based on these facts, chitosan can be used as a condensing agent to enhance the transfection efficiency of cationic liposome. In the present study, we investigated the association and dissociation kinetics of DNA with the two kinds of nonviral gene delivery systems: DOTAP/DOPE cationic liposome and chitosan, prepared and characterized the liposome/chitosan/DNA complex (LCD), and evaluated the transfection efficiency of this LCD complex. The main results are as follows:Stopped-flow fluorescent spectrophotometry was used to