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Dravet 综合征患者体细胞重编程前后基因组微失衡的相关研究硕士研究生：曹定娅导师： 孙筱放 教授专业： 妇产科学（生殖与遗传）中文摘要Dravet 综 合 征 又 称 婴 儿 重型 肌 阵 挛 性 癫 痫 (severe myoclonic epilepsy in infancy，SME)，是一种罕见的主要由遗传因素引起的恶性癫痫综合征，常伴有 认知损害及自闭症倾向。具有发病年龄早、发作形式复杂、发作频率高、智力 损害严重、药物治疗有效率低、预后差、死亡率高等特点，是热性惊厥叠加全 面性癫痫附加征（GEFS+）中最严重的表型。分子遗传学研究证实 Dravet 综合 征 与 电 压 依 赖性 钠 通道 a1-亚 单位 (voltage-gated sodium channel a1-subunit ， SCN1A)基因突变密切相关。随着比较基因组杂交技术 （microarray comparative genome hybridization,aCGH ）的发展，科学家发现在 Dravet 综合征患者基因组 中某些拷贝数变异(copy number variations,CNVs)与难治性癫痫密切联系，涉及 SCN1A、EPHA5 等易感基因。随着 iPS 技术的兴起，为建立 Dravet 综合征体外 模型提供了新的研究思路，减少了伦理、法律及免疫排斥等问题。目前很多研 究建立的特定诱导分化体系中所使用的诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)遗传背景不一样，因其细胞来源个体本身就存在显著基因组差 异。因此，研究干细胞基因组稳定性至关重要。本研究选择新型强大的细胞遗 传分析平台—aCGH，准确而快速地发掘和诊断 CNVs；利用 Dravet 综合征患者 的皮肤成纤维细胞重编程为 iPSCs，分析这种疾病体细胞及相应 iPSCs 的基因组CNVs。本研究表明，患者家系中 SCN1A 相同位点基因突变者的症状不尽一致，这些可能与各自存在不同的 CNVs 密切有关。体细胞存在与癫痫相关的致 病性 CNVs；通过重编程，早代 iPSCs 基因组状态不稳定，增加许多 CNVs，该 区域涉及与细胞循环、凋亡、肿瘤等相关的基因。第一部分 Dravet 综合征-iPS 系的建立及其生物学特性鉴定【研究目的】了解患病家系 SCN1A 基因突变情况及症状，重编程 Dravet 综合征先证者成 纤维细胞，获得 iPS 细胞并进行鉴定，为后续研究疾病的发生机制、诱导分 化、药物筛选及表观遗传学研究等方面提供良好的模型。【研究方法】1. 测序验证先证者家系 SCN1A 基因突变情况。2. 收集 Dravet 综合征先证者皮肤成纤维细胞并培养。利用逆转录病毒介导的四 个转录因子重编程患者成纤维细胞，筛选出 iPSCs，当克隆形态较大时机械 挑取进行传代。3. 选取生长状态良好的 iPS 克隆进行多能性、体外分化、核型、STR 及 SCN1A基因突变的鉴定。【结果】1. 先证者及其父亲、弟弟均为 SCN1A 突变 c.4284+2T C。父子三人症状不同。2. 先证者成纤维细胞的培养，可见组织块边缘有长梭形纤维细胞长出。先证者 iPS 细胞的诱导。感染后大约 20 天可获得 iPS 细胞克隆。iPS 细胞碱性磷酸酶 染色为强阳性，镜下见克隆中细胞密集区出现紫黑色颗粒，从 AP 染色结果 发现 iPS 细胞形成效率约为 0.20%。3. iPSCs 能维持自我更新状态，具有与 ES 细胞相似的形态、多能性和体外分化能力，重编程前后其核型、STR 位点及 SCN1A 基因突变与患者体细胞一 致。【结论】1. 本患病家系中 SCN1A 相同位点突变但症状轻重不同，可能与 SCN1A 的表达 调控及其它癫痫相关基因突变或用药状况有关。该家系适合建立体外模型进行 机制研究。2. 成功建立一株 Dravet 综合征 iPS 细胞系，为研究疾病的发生机理、诱导分 化、药物筛选及表观遗传学研究等方面提供良好的细胞模型。【关键词】Dravet 综合征；SCN1A 基因突变；发病机理；诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）；疾病模型第二部分 Dravet 综合征重编程前后基因组微失衡的相关研 究【研究目的】1. 分析 Dravet 综合征家系中各受检者基因组拷贝数的变异。2. 研究 Dravet 综合征家系中父子三人症状差异与基因组拷贝数变异的关系。3. 研究重编程过程是否影响基因组稳定性，进一步探讨 iPS 建系的有效性。【研究方法】利用高分辨率的 Affymetrix CytoScan HD 芯片检测 Dravet 综合征家系中不同 患者，分析与癫痫症状相关的基