第六章 凝胶过滤-1.pptVIP

第六章 凝胶过滤 本章提要 凝胶的分类和性质 基本原理 凝胶层析操作 应用 凝胶过滤（gel filtration): 又称分子筛层析（molecular sieve chromatography)或 排阻层析。 原理：凝胶具有内部网状结构，小分子物质能进入其内部，路径长，后跑出层析柱；大分子物质被排阻在外，路径短，先跑出层析柱，这样，不同大小的分子就得到了分离。 第一节凝胶的分类及性质 1.1 葡聚糖凝胶（Sephadex） 交联度： 交联剂在凝胶中占的百分数。 交联度大－－孔径小－－能分离的分子量小 2) 排阻极限：不能扩散到凝胶基质内部中去的最小分子量。 3) 分级范围：能分离的分子量范围。 4) 吸水量：1g干凝胶所吸收水分的量。 如：G-50的吸收量为5.0g 5) 凝胶颗粒：用筛目表示，100～200目 6) 稳定性：化学稳定性高 1.2 琼脂糖凝胶（ Sepharose） 美国称：Bio-gel A 英国称：Segavac 型号：按琼脂糖的浓度，分为： Sepharose 2B（2%)， Sepharose 4B（4%)， Sepharose 6B（6%)。 CL-型交联琼脂糖凝胶： ?Sepharose与1,3-二溴异丙醇在强碱条件下生成； ? pH应用范围更广：pH3~14 ? Sepharose －CL-4B：可以用作疏水层析介质的基质 1.3 聚丙烯酰胺凝胶 单体：丙烯酰胺（Arc） 交联剂：N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis) 理化性质： ?珠状颗粒，用前需溶胀； ?稳定性好，pH1~10的缓冲液中稳定； 1.4 Sephacryl 由烯丙烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联而成。可用于分离蛋白质、核酸、多糖、蛋白聚糖等。 1.5 Superdex 由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价连接而成。 理化性质： ?稳定性好，pH3~12稳定 ?良好的分子筛特性 第二节 基本原理 凝胶过滤介质内部具有立体网状结构，颗粒内部有一定大小的筛孔。 凝胶床总体积：Vt＝Vo＋Vi＋Vg ?Vo：凝胶颗粒外水体积 ? Vi：凝胶颗粒内水体积 ? Vg：干胶颗粒体积 1)分配系数Kav 表征了任何一种物质在凝胶层析中的被排阻程度。 Kav＝（Ve－Vo)/（Vt-Vo) Ve：洗脱体积 Vt：凝胶床总体积 Kav是判断分离效果的一个重要参数，各组分之间Kav差异越大，分离效果越好。 Kav 的测定 Kav＝（Ve－Vo)/（Vt-Vo) ? Vt的计算：Vt=пr2h 或Vt=Vo+Vi+Vg＝Vo+Vi ? Vo:外水体积，用蓝色葡聚糖2000（M=200万）测定；Ve=Vo ？ ?Vi：内水体积，用小分子物质（硫酸铵等）测定，Ve=Vo+Vi ？ 第三节凝胶层析操作 3.1 凝胶的选择和处理 3.1.1凝胶的选择 1)型号：根据被分离物分子量大小来确定 如：脱盐：用Sephadex G-25 2)粒度： ?粗、中粒度：流速快、分辨率低； ?细粒度：分辨率高、但流速慢； 3.1.2凝胶用量的计算 干胶用量＝柱体积/膨胀度 （再加10~20%） 3.1.3凝胶的处理 凝胶－－蒸馏水或缓冲液浸泡－－除去细颗粒－－0.5mol/L的NaOH-NaCl溶液浸泡－－抽滤－－洗至中性 凝胶过滤 *