egfp审审egf1蛋白结合隐形纳米粒的脑血栓靶向递药研究word格式论文.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 EGFP-EGF1 蛋 白 结 合 隐 形 纳 米 粒 的 脑 血 栓 靶 向 递 药 研 究 中文摘要 脑血栓性疾病以极高的致死率、致残率危害着人们的健康，但现行的治疗中全 身给药伴随着很高的出血意外，介入治疗虽然有针对性但是存在着较高的手术风险、 较高的再梗塞率和较窄的适用人群。靶向给药，通过全身给药的方式就能像介入一样 在局部形成高浓度，同时回避了手术风险；因为大大降低了全身给药量又最大程度地 控制了出血风险，因而具有极大的研究价值。 众所周知，组织因子（tissue factor，TF）在整个凝血瀑布中扮演了扳机点的 角色；而对于急性心、脑血管事件，血管损伤所释放的 TF 与血液中的凝血因子Ⅶ （coagulation factor Ⅶ，FⅦ）特异性结合是重要的始动因素。FⅦ与 TF 结合的部 位主要位于类表皮因子一区（EGF1）和 SP 区，EGF1 可以与 TF 特异性结合但是没有促 凝血活性，因此在前期研究中我们基于大鼠 FⅦ的 EGF1 区的结构制备了 EGFP-EGF1 融合蛋白，并对其与 TF 的结合功能做了一系列研究。研究表明将 EGFP-EGF1 蛋白作 为靶向功能基连接在聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）纳米粒的表面，能明确靶向到 TF 表达部位，在体内、外试验中均得到验证。 由于采用聚乳酸-聚羟基乙酸（PLGA）制备的纳米粒比 PLA 纳米粒具有更高的基 因转染效率，于是本研究采用 PEG-PLGA 作为聚合物材料制备纳米粒，以 EGFP-EGF1 作为靶向性头基，与之共价连接制备了新型的药物递送系统—EGF1-EGFP-NP。该纳米 粒以受体介导的方式增加其脑梗塞部转运，将该生物可降解的纳米粒作为药物的载 体，不仅安全性好，还能显著提高药物的稳定性和输送能力；纳米粒采用复乳/溶媒 蒸发法制备，适合于包载水溶性大分子药物，比如蛋白、多肽和基因药物，可以掩盖 其自身的理化性质，代之以纳米粒的特性；纳米粒表面经过 PEG 修饰，可以避免单核 巨噬系统的吞噬，延长在血浆中的半衰期，提高药时曲线下面积（Area under curve,  AUC），具有长循环作用。 本文第一部分为 EGF1-EGFP-NP 的制备与表征，它是通过复乳/溶媒蒸发法将马来 酰胺亚胺封端的聚乙二醇-羟基乙酸共聚物（Maleimide-PEG-PLGA）和单甲氧基聚乙 二醇乳酸-羟基乙酸共聚物（MPEG-PLGA）按照 1：10 的比例混合制备 NP，并通过表面 的 Maleimide-PEG 与巯基化的 EGFP-EGF1 蛋白共价结合而成。该纳米粒的平均粒径为 100 nm 左右形态圆整、规则，Zeta 为-15 mV 左右。免疫电镜观察结果证实纳米粒子 表面共价结合有 EGFP-EGF1，并计算出表面连接的蛋白数目为 112±7 个。 为了评价 EGF1-EGFP-NP 的 TF 靶向递药特性与毒性，本文第二部分制备了高纯度 的原代大鼠 BCEC，用 TNF-α 成功复制了 BCEC 表达 TF 的细胞模型。以 6-香豆素作 为荧光探针，对 EGF1-EGFP-NP 的 BCEC 内递药特性进行了评价，结果表明 6-香豆 素在 NP 和 EGF1-EGFP-NP 中 24 h 内的体外渗漏率低于 3.62%，能准确示踪其体内外 的生物学行为。 BCEC 对纳米粒的摄取结果表明，异常表达 TF 的 BCEC 对 EGF1-EGFP-NP 的摄取存在 TF 与 EGF1 结合介导的摄取增强效应。细胞活力测定结 果显示，EGF1-EGFP-NP 与 NP 比较，其 IC20 和 IC50 均无显著性差异，证实了 EGF1-EGFP-NP 具有良好的生物安全性。通过以上体外实验证明，EGF1-EGFP-NP 是 一种具有 TF 介导的递药特性且毒性较低的药物传递系统。 第三部分以光化学法复制的大鼠皮质微血栓模型为基础，首先以6-香豆素为荧光 探针通过药动学的方法研究了EGF1-EGFP-NP的脑内递送特点。结果发现EGF1-EGFP-NP 与NP相比其脑血栓部位的靶向指数为2.58；组织分布的结果表明肺脏和肾脏的分布有 所增加，肝脏有所降低。通过以Dir为荧光探针进行活体与器官成像结果表明，在对 应脑血栓照射部位，各时间点EGF1-EGFP-NP表现的荧光强度都高于NP，通过器官成像 及定量分析发现1 h、4 h和24 h在脑血栓形成部位EGF1-EGFP-NP的浓度为NP的两倍以 上，其中以1 h时最高，为2.66倍。脑组织微观和超微水平观察结果显示，梗塞灶内 的EGF1-EGFP-NP基本分布在梗塞灶的血管内，而且与局部表达的TF定位一致，这表明 其有明确的TF靶向效能。通过TEM观察发现EG