酵母醇脱氢酶的提纯及应用分析-purification and application analysis of yeast alcohol dehydrogenase.docxVIP

第一章绪论1.1生物大分子纯化方法概述沉淀法沉淀是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象[1]。与结晶相比，沉淀是不定形的固状物，构成成分复杂。由于各种生物分子的分子结构不同，其水化层的稳定程度各异，它们达到沉淀所要求的盐浓度(离子强度) 亦不同[2,3]。有机溶剂沉淀法应用于分离生物大分子，其分辨率高于盐析；因溶剂沸点较低，除去及回收方便。但有机溶剂沉淀法比盐析法易使蛋白质变性失活，通常在低温下操作，以减少变性作用[4-7]。萃取法利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法称为萃取。双水相技术迅速发展，为蛋白质特别是胞内蛋白质的提取纯化提供了有效的手段[8]，但主要问题是在分离后需要进一步纯化，以除去高分子聚合物和盐类等杂质[9,10]。在传统的有机溶剂萃取技术的基础上，出现了可应用于生物大分子如多肽、蛋白质、核酸等分离纯化的反胶束萃取法[11-13]。层析法层析法[14]是利用不同结构或不同性质的物质，在不相混溶的两相中分布(溶解、吸附或其他作用)的差异而进行分离。将其中一相固定(称固定相)，而使另一相流动(称流动相)时，则混合物质被流动相带动，不同组分因分布的差异而沿固定相以不同的速度向前移动。经过一段时间后，各组分移动的距离有明显的区别，因而得以分离。层析法有多种类型，广泛应用于生物分子的分离与纯化[15-19]。电泳法电泳是指带电荷的胶体粒子在直流电场中流动的现象。不同的物质由于其带电性质及其颗粒大小和形状不问，在一定的电场中移动方向和移动速度也不同，故此可使混合物分离。电泳技术设备简单操作方便，有很高的分辨率和选择性，分离成分的检出可利用染色，紫外吸收，放射性测定等，有高灵敏度，在生化研究和临床检验方面发挥了巨大作用[20-24]。1.2抑制剂对酶的作用及酶分析法概述1.2.1抑制剂对酶的作用凡能降低酶促反应速度的作用，称为酶的抑制作用。由于通过酶抑制作用的研究，不仅对了解酶的专—性，酶活性部位的物理和化学结构，酶的动力学性质以及酶的作用机制等；而且对了解药物和毒物作用于机体的方式及机理等也有重要意义；对代谢途径中酶的调节也能提供信息[25]。因此，近年来对酶抑制作用的研究进展迅速[26-31]。抑制剂能使酶的必需基团或活性部位的性质和结构发生改变，从而导致酶活性降低或丧失。图1.1酶与底物或者抑制剂结合的中间产物示意图（a）竞争性抑制（b）非竞争性抑制酶的抑制剂有多种多样，无机和有机的，低分子和高分子的，具有特异性和不具有特异性的等等。在酶化学中研究比较多的抑制剂是：重金属离子(如Ag+，Hg2+，Cu2+)、一氧化碳、硫化物、氰氢酸、氟化物、有机正离子(如生物碱，染料等)、碘代乙酸、对氯汞苯甲酸、二异丙基氟磷酸、乙二胺四乙酸以及表面活性物质如麻醉剂等[32]。酶反应的产物本身也可以产生抑制作用。酶的抑制作用可分为可逆和不可逆两种类型。图1.2 几种可逆抑制的动力学曲线1.2.2 酶分析法酶分析法是借助于酶高效、高度专一的催化作用，以酶作为分析试剂或分析工具进行的一类分析，可用以检测样品(如食品、药物以及体液等)中某种物质的含量[33-36]。测定的范围很广，凡是与酶反应有关的物质，如酶的底物、辅助因子、甚至酶的抑制剂等都能采用这类分析方法。在具体实施时，只需根据待分析对象选择一种适宜的“工具酶”，并在该分析对象存在条件下进行反应，然后借助物理方法或化学方法跟踪检测，最后根据待测对象与酶反应的关系，将测得的结果进行动力学分析处理，就可以求得所要检测物质的含量[37-40]。酶法分析有两个主要优点，即专一性和灵敏性。所谓的专一性是指酶往往仅对同系物中的一种或少数几种化合物具有催化活性。对其余共存物质则无作用。这就可以避免生物试样中众多共存物质对分析的干扰，减少繁杂的预处理或分离过程。酶法分析的另一个特点是灵敏度高，能检测pg 或者ng 级的底物、激活剂或抑制剂，主要是出于酶的催化放大作用较强。酶法分析的发展趋势是简便化、微量化、连续化和自动化。1.3反胶束简介反胶束是表面活性剂溶解在非极性溶剂中形成的、围绕一个极性核的纳米级聚集体，是透明的、热力学稳定的体系[41,42]。反胶束极性内核中的水与常态水物理性质不同，它的黏度较高，而酸度与极性比常态水低。所以“水池”中的水可溶解某些原本不溶的物质，如脂肪酶等生物活性物质[43-46]。1.3.1反胶束溶液中的酶学性质反胶束具有如下的优点：极性“水核”具有较强的溶解能力；生物大分子具有较强的极性，可溶解于极性水核中，防止与外界有机溶剂接触，减少变性作用；由于“水核”的尺度效应，可以稳定蛋白质的立体结构，增加其结构的刚性，提高其反应性能。因此，反胶束可作为酶固定化体系[47-49]，用于水不溶性底物的生物催化。当含有此种反胶