PrP105132作用下体外小胶质细胞的活化及其IL8的产生.docVIP

PrP105132作用下体外小胶质细胞的活化及其IL8的产生 【摘要】目的 探讨PrP105132作用下体外小胶质细胞的活化及其IL8的产生。方法 体外培养大鼠神经胶质细胞，用不同剂量PrP105132(0、20、40、80 μmol/L)干预小胶质细胞，ELISA法检测24 h后细胞上清液中IL8含量。结果 朊蛋白肽段干预后小胶质细胞活化，胞体增大，细胞突起变短、消失，呈圆状、杆状、阿米巴状;并且随PrP105132剂量的增加，IL8分泌量增多(P0.01)。结论 PrP能够诱导体外小胶质细胞分泌IL8，并且具有剂量依赖关系。 【关键词】 朊蛋白;小胶质细胞;白细胞介素8　【Abstract】 Objective To investigate the microglia secreting interleukin(IL8) in the condition of PrP105132. Methods The rat microglia culture were exposed to PrP105132(0、20、40、80　mu;mol/L) in vitro. The IL8 levels in cell supernatant were measured by commercial enzyme immunoassay (ELISA) after 24 h. Results In the condition of PrP peptide, the microglia were activated. A dosedependent increase in IL8 secretion by the PrP105132 exposed rat microglia was obtained.Conclusions PrP may induce microglia secreting IL8. 【Key words】 Prion; Microglia; Interleukin8 朊蛋白病又称传染性海绵状脑病(TSEs)，是一类人畜共患的致死性神经退行性疾病〔1〕。大量研究结果都支持朊蛋白病的主要致病机制是由正常PrPC转变成异常PrPSC〔2〕，其中活化的小胶质细胞在这一结构转变中起着重要作用〔3〕。笔者在先前的实验中发现克雅氏病患者脑脊液中前炎症细胞因子IL8含量升高〔4〕。本实验中用PrP干预体外小胶质细胞，使之活化，探讨朊蛋白病中IL8的可能来源。 1 材料与方法 1.1 朊蛋白肽段处理 PrP105132肽段(KTNLKHVAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSA)采用固相合成法合成，实验前取少量肽段放入离心管中，先用适量的稀乙酸溶解，然后再加入双蒸水进行稀释，并用稀乙酸将其调回中性pH值。 1.2 细胞培养 1.2.1 神经胶质细胞混合培养 取10只新生Wistar大鼠(出生1 d)，在无菌条件下，剪开颅骨，取出脑组织(皮质和髓质)至盛有加糖DHanks液的培养皿中反复冲洗以去除血污。剥离脑表面的脑膜和血管，用加糖DHanks液洗脑组织块1～2次。剪碎脑组织块至1～3 mm，加入体积比组织块总量多30～50倍的胰酶，在37℃条件下用吸管反复吹打消化液变混浊。加入完全培养液(高糖的DMEM/F12 1∶1培养液+10%胎牛血清)终止消化，再次吹打制成单细胞悬液，将细胞悬液转移至消毒离心管中，配平。离心1 000 r/min，10 min，弃上清。加定量完全培养液再次制成细胞悬液，接种入6个50 ml细胞培养瓶，密度为100 000～120 000个细胞/cm2。置于培养箱中，37℃条件下培养。 1.2.2 小胶质细胞的分离、纯化、传代 第3天更换1次培养液，不换液培养10～12 d后再更换培养液，24 h后用DHanks液3∶1稀释胰酶EDTA溶液(0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA，1∶1)，37℃下作用40 min;轻轻晃动培养瓶，使贴附在底层星型胶质细胞上的小胶质细胞脱落下来，将含漂浮小胶质细胞的培养液转入培养瓶中，24 h后更换培养液。待细胞长满后，再次用胰酶消化进行传代培养，得到小胶质细胞。 1.3 培养细胞的免疫细胞化学染色 待小胶质细胞长成片后，取出盖片，依次进行0.9%盐水清洗3次，每次5 min;4%多聚甲醛固定40 min;0.01 mol/L磷酸缓冲液(pH7.3)清洗3次，每次5 min，放入4℃冰箱备用。SP法免疫细胞化学染色。 1.4 PrP105132处理体外小胶质细胞 1.4.1 体外小胶质细胞分泌IL8含量的测定 体外培养小胶质细胞24、48及72 h，收集细胞上清液，-20℃保存。IL8含量检测采用ABC夹心ELISA法。