PrP105132对体外小胶质细胞活化及IL6产生的影响.docVIP

PrP105132对体外小胶质细胞活化及IL6产生的影响 【摘要】目的 探讨PrP105132作用下体外小胶质细胞的活化及对IL6产生的影响。方法 体外培养大鼠神经胶质细胞，用不同剂量PrP105132(0、20、40、80 μmol/L)干预小胶质细胞，ELISA法检测24 h后细胞上清液中IL6含量。结果 朊蛋白肽段干预后小胶质细胞活化，胞体增大，细胞突起变短、消失，呈圆状、杆状、阿米巴状;并且随PrP105132剂量的增加，IL6分泌量增多(P0.01)。结论 PrP能够诱导体外小胶质细胞分泌IL6，并且具有剂量依赖关系。 【关键词】 朊蛋白;小胶质细胞;白细胞介素6　【Abstract】 Objective To investigate the microglia secret IL6 in the condition of PrP105132. Methods Rat microglia culture was exposed to PrP105132(0, 20, 40, 80 mu;mol/L) in vitro. The IL6 level in cell supernatant was measured by commercial enzyme immunoassay (ELISA) after 24 h. Results Microglia were activated in the condition of PrP peptide. A dosedependent increase in IL6 secretion by the PrP105132 exposed rat microglia was obtained. Conclusions PrP may induce microglia secret IL6. 【Key words】 Prion; Microglia; Interleukin6 朊蛋白病又称传染性海绵状脑病(TSEs)，是一类人畜共患的致死性神经退行性疾病，主要病理特征为脑组织中存在淀粉样改变，其主要成分为异常PrP沉积，周围可见大量的胶质细胞〔1〕。胶质细胞在神经元的生存和整个生命活动中起着支持、营养、保护和修复等重要作用，并具有不同的免疫活性，构成中枢神经系统(CNS)抵御病原体入侵的第一防线。细胞因子是固有免疫反应和适应性免疫反应的关键调节剂。在CNS感染性疾病中，组织浸润性免疫细胞、CNS相关的巨噬细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞已经被确定为CNS特异性炎症中细胞因子的来源。然而，无论是在疾病条件下还是在培养体系中，是小胶质细胞而不是星形胶质细胞作为关键的前炎症细胞因子和免疫调节性细胞因子的主要来源〔2〕。通过研究克雅氏病患者脑脊液，发现前炎症细胞因子白介素(IL)6在脑脊液中含量升高〔3〕。本实验应用PrP干预体外小胶质细胞，旨在进一步明确朊蛋白病中IL6的可能来源。 1 材料与方法 1.1 朊蛋白肽段处理 PrP105132肽段(KTNLKHVAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSA)采用固相合成法合成，实验前将本条多肽取少量放入离心管中，先用适量的稀乙酸溶解，然后再加入双蒸水稀释，并用稀乙酸将其调回中性pH值。 1.2 细胞培养 1.2.1 神经胶质细胞混合培养 取10只新生Wistar大鼠(出生1 d)，在无菌条件下，剪开颅骨，取出脑组织(皮质和髓质)至盛有加糖DHanks液的培养皿中反复冲洗以去除血污。剥离脑表面的脑膜和血管，用加糖DHanks液洗脑组织块1～2次。剪刀剪碎脑组织块至1～3 mm，加入体积比组织块总量多30～50倍的胰酶，在37℃条件下用吸管反复吹打消化液变混浊。加入完全培养液(高糖的DMEM/F12 1∶1培养液+10%胎牛血清)终止消化，再次吹打制成单细胞悬液，将细胞悬液转移至消毒离心管中，配平。离心1 000 r/min，10 min，弃上清。加定量完全培养液再次制成细胞悬液，接种入6个50 ml细胞培养瓶，密度为100 000～120 000个细胞/cm2。置于培养箱中，37℃条件下培养。 1.2.2 小胶质细胞的分离、纯化、传代 第3天更换1次培养液，不换液培养10～12 d后再更换培养液，24 h后用DHanks液3∶1稀释胰酶EDTA溶液(0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA，1∶1)，37℃下作用40 min。轻轻晃动培养瓶，使贴附在底层星型胶质细胞上的小胶质细胞脱落下来。将含漂浮小胶质细胞的培养液转入培养瓶中，24 h后更换培养液。待细胞长满后，再次用胰酶消化进行传代培养，得到小胶质细胞。 1.3 培养细胞的免疫细胞化学染色 待小胶质细胞长成片后，取出盖片，依次进行0.9%盐水清