混合模式色谱柱在抗生素质量研究中的应用暨头孢曲松降解杂质分析-application of mixed-mode chromatographic column in the study of antibiotic quality and analysis of ceftriaxone - degrading impurities.docx

中文摘要本论文主要研究了两性离子交换-反相-亲水作用（ZIC-RP-HILIC）混合模式色谱柱的应用及其机理；并利用ZIC-RP-HILIC-MS联用技术，确证第三代头孢菌素类抗生素头孢曲松的降解杂质，考察此药物的稳定性，并对新发现的头孢曲松色谱行为互变现象进行研究，建立更加科学、全面的质量控制方法。Ⅰ两性离子交换-反相-亲水作用（ZIC-RP-HILIC）混合模式色谱柱的应用及机理研究目的：利用两性离子交换-反相-亲水作用（ZIC-RP-HILIC）混合模式色谱柱的不同分离模式，1.建立一种药物盐离子含量测定的方法，弥补药典中药物成盐量质控方法的空白；2.代替离子对试剂分离分析强极性化合物，建立一种强极性化合物杂质分离、结构确证的方法；提出一种新的二维色谱杂质峰相互识别的方法及杂质结构确证的途径，尤其解决了强极性化合物结构确证难的问题（即离子对试剂与MS不相容的问题）；3.探讨该色谱柱的分离机制，以便快速筛选适合分离的化合物，给实际分析工作带来方便。方法：1.采用ZIC-RP-HILIC混合模式色谱柱-蒸发光检测器（ZIC-RP-HILIC–ELSD），乙酸铵缓冲盐，建立抗生素药物成盐离子的含量测定方法，并进行了方法学验证；2.利用ZIC-RP-HILIC混合模式色谱-RP色谱-柱切换技术，以青霉素V钾、苯唑西林钠、头孢曲松钠为例，建立了常规药典RP色谱方法和ZIC-RP-HILIC混合模式色谱方法的二维相关色谱分析方法，对RP和ZIC-RP-HILIC色谱系统中的降解杂质峰进行相互识别，并利用MS技术确定杂质结构；3.利用Discoverstudio软件预测药物分子的结构参数，探讨ZIC-RP-HILIC混合模式色谱柱与化合物性质之间的关系，确定该色谱柱的适用范围。结果：1.建立了一种新的HPLC测定药物盐离子含量的方法，该方法准确可靠，操作简便；2.建立了一种ZIC-RP-HILIC混合模式色谱-RP色谱二维色谱相关分析法，进行抗生素杂质研究，实验证明该方法简单易行，在代替离子对试剂对强极性化合物杂质进行分离和结构确证方面有较大优势；3.找出了与化合物色谱行为密切相关的四个化合物参数，确定了该色谱柱适合分析的化合物类型。结论：ZIC-RP-HILIC混合模式色谱柱在离子交换模式下（高盐相）分离药物盐离子、在亲水模式下（高有机相）分离强极性化合物方面有较大优势，并且其流动相为挥发性缓冲盐，易于MS匹配，用于杂质结构确证。利用线性自由能方程式描述色谱柱与化合物性质之间的关系，是一种表征色谱柱性能的良好方法。Ⅱ头孢曲松降解杂质研究目的：由于头孢曲松强极性的特点，其分离方法为反相离子对色谱法，该分离方法操作复杂，不易与MS联用，并且头孢曲松在有机酸中降解严重，结合ZIC-RP-HILIC混合模式色谱柱的特点，进行头孢曲松降解动力学研究和降解杂质研究，对新发现的头孢曲松色谱行为互变现象进行研究，建立头孢曲松更加全面、科学的质量控制方法。方法：本文以头孢曲松为研究对象，进行加速稳定性试验，考察各影响因素对头孢曲松降解速率的影响；利用ZIC-RP-HILIC混合模式色谱柱-MS联用技术确定头孢曲松降解杂质的结构，发现了一种头孢曲松在色谱中的互变共存结构，利用NMR技术确定该共存化合物的结构，并找出其产生的原因。结果：头孢曲松在有机酸中（甲酸、乙酸），三位侧链易发生水解反应，生成含羟基化合物和三氮唑，并在不同pH下产生不同的电离状态，在色谱中表现出不同的保留时间，这种现象在离子对试剂存在下异常显著。因此在利用反相离子对色谱分离含有多个电离位点的化合物时，控制流动相的pH值使化合物处于一种电离状态至关重要。结论：头孢曲松在有机酸中发生严重降解，这种现象是一种共性问题还是只发生在C-S键处，有待进一步研究；反相离子对色谱法在药物质量控制中应用较多，但是该方法影响因素较多，分析方法的好坏及可控性也是质量控制方法的研究重点。关键词：混合模式色谱柱，盐离子，二维色谱相关法，柱切换，HPLC-MS，反相离子对色谱，头孢曲松，降解杂质，核磁共振波谱AbstractThisthesisstudytheapplicationandmechanismofzwitterionexchange-reversedphase-hydrophilicinteraction(ZIC-RP-HILIC)mixed-modecolumn;UsingZIC-RP-HILICmixed-modeliquidchromatography-MassSpectrometrytechnologytoidentifyimpuritiesofceftriaxoneofthethirdgenerationcephalosporinantibioticsanddeterminethestab