grb10cdk5rap3在hek293t细胞中与apoptin蛋白相互作用的研究-study on the interaction between grb 10 cdk5 rap 3 and ap optim protein in hek 293 t cells.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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grb10cdk5rap3在hek293t细胞中与apoptin蛋白相互作用的研究-study on the interaction between grb 10 cdk5 rap 3 and ap optim protein in hek 293 t cells

主要英文缩写词AmpAmpicilin氨苄青霉素ApoptinApoptosisinduceprotein凋亡素bpbasepair(s)碱基对BSAbovineserumalbumen牛血清白蛋白CDK5RAP3CDK5regulatorysubunitassociatedprotein3CDK5调节亚基相关蛋白3cDNAcomplementaryDNA互补脱氧核糖核酸DEPCdiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯DMSOdimethylsulphoxide二甲基亚砜EBethidiumbromide溴化乙锭FBSfetalbovineserum胎牛血清GRB10growthfactorreceptor-boundprotein10生长因子受体结合蛋白10Kbkilobasepair(s)千碱基对HATagHemagglutininTag红细胞凝集素标签HISTagHistidineTag多聚组氨酸标签PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应PBSphosphate-bufferedsaline磷酸缓冲液GRB10/CDK5RAP3在HEK293T细胞中与Apoptin蛋白的相互作用的研究中文摘要Apoptin/VP3（凋亡素）是一种来源于鸡贫血病毒（CAV）的小分子蛋白，由121个氨基酸构成，其能通过线粒体途径诱导肿瘤细胞和转化细胞凋亡，对正常细胞没有毒副作用，其诱导肿瘤细胞选择性凋亡并不依赖p53途径，不受抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的调节，但其作用机制尚未完全阐明。前期实验室课题组以His-Apoptin融合蛋白诱饵，通过pull-down技术获得可能与Apoptin相互作用蛋白多种，包括HSPA9,GRB10,GRB14,CDK5RAP3,TNFAIP1等。其中HSPA9已经被验证其在HepG2细胞中能与Apoptin蛋白发生相互作用关系，并影响其特异性诱导肿瘤细胞凋亡效应。目的通过研究GRB10/CDK5RAP3与Apoptin在HEK293T细胞中的相互作用，为Apoptin相关蛋白研究提供可能的线索，从而为Apoptin的选择性诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究提供可能的目标蛋白。方法通过分子克隆技术，构建带有-HIS标签的GRB10和CDK5RAP3的真核表达载体，经酶切、测序鉴定后，将其与已经构建好的HA-Apoptin质粒通过脂质体共转染入HEK293T细胞，然后提取细胞蛋白，通过免疫共沉淀技术，免疫印迹技术，检测GRB10/CDK5RAP3是否与Apoptin在HEK293T细胞中发生相互作用。结果我们成功构建了带-HIS标签的GRB10和CDK5RAP3真核表达载体。并将其单独转染和其与Apoptin质粒共转染于HEK293T细胞中均获得了表达。共转染细胞后，蛋白进行免疫共沉淀和免疫印迹，结果表明，在HEK293T细胞中GRB10和Apoptin蛋白可能不存在直接的相互作用。在HEK293T细胞中同样也未观察到CDK5RAP3和Apoptin的相互作用。结论1.在HEK293T细胞中，GRB10与Apoptin可能不存在直接的相互作用。2.在HEK293T细胞中，CDK5RAP3与Apoptin可能不存在直接的相互作用。关键词：GRB10；CDK5RAP3；Apoptin；相互作用；免疫共沉淀ResearchontheexpressionandfunctionofGRB10/CDK5RAP3interactingwithApoptinintumorAbstractApoptin,a13.6-kDproteinencodedbychickenanemiavirus,ispaidmoreandmoreattention,sinceitselectivelyinducesapoptosisintumorcellsandtransfectedcellbutnocytotoxiceffectinnormalcells.StudiesshowedthatApoptinisp53-independent,Bcl-2-insensitiveapoptoticproteinThemechanismofApoptinislargelystillunknown.His-Apoptinfusionproteinasabait,weobtainvariouspossibleinteractingproteiswithApoptinbyPULL-DOWNtechnoloy,including:HSPA9,GRB10,GRB14,TNFAIP1andsoon.HSPA9,oneofthesepossibleproteins,hasbeenidentifiedasaninteractingprot