grp78 chop trb3在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用研究-effect of grp 78 chop tr b3 on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.docxVIP

血再灌注损伤发生发展。关键词大鼠；脑缺血再灌注；内质网应激；GRP78；CHOP；TRB3；细胞凋亡前言随着生活水平提高、生活方式改变及人口老龄化加剧，脑血管疾病发病率明显上升，其高致残率及高病死率的特点给人们的健康带来了极大的危害，也加重了人们的经济负担，其中缺血性脑血管病占60～80%[1]。脑缺血后部分血管能自然再通或经溶栓治疗后恢复再通，但随之而来的是出现再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤（cerebralischemia-reperfusioninjury，CIRI）是指因脑缺血致脑组织坏死前，闭塞的脑血管再通后缺血性损伤却进一步加重的现象[2]，最终导致神经细胞坏死或凋亡，脑缺血再灌后细胞凋亡可能是脑细胞的一种迟发性死亡。近年来研究发现，内质网应激（endoplasmicreticulumstress,ERS）介导的凋亡途径是除死亡受体介导的信号转导途径和线粒体途径之外的一种新的诱发凋亡途径[3]，内质网应激是脑缺血再灌注损伤中的一个重要环节[4]，是诱导脑细胞凋亡的重要机制之一[5]。但其在脑缺血再灌注损伤发生发展过程中如何引起脑细胞凋亡，目前机制尚不完全清楚。内质网（endoplasmicreticulum,ER）是蛋白质的合成、翻译后修饰、折叠组装以及脂质合成、细胞内钙离子储存的场所，在细胞的生长、存活以及分化中起到至关重要的作用，当组织细胞受到缺血缺氧、炎症及氧化应激等病理条件的刺激时，可导致细胞内内质网应激，内质网应激是细胞的一种适应性保护机制，适当的内质网应激可维持细胞内环境稳定[6]。但长时间过强的内质网应激会使未折叠蛋白持续增加，引起细胞功能失调，内质网应激由促细胞生存的保护效应向促细胞凋亡效应转化，导致内质网应激相关性凋亡[7]。内质网应激相关性凋亡途径近年受到广泛关注，而在内质网应激引起的凋亡过程中涉及到的凋亡相关蛋白更是研究的热点。GRP78是内质网首个被发现的分子伴侣，正常情况下，GRP78与信号感受蛋白、Caspase-12等以复合体形式存在神经元细胞中，起抗凋亡作用[8-10]。当脑缺血再灌注后内质网应激超过一定程度与时间，复合体发生解离，游离的Caspase-12直接激活Caspase-9，后者活化Caspase-3等死亡效应蛋白酶，导致细胞凋亡[11]。内质网应激相关分子CHOP是内质网应激蛋白GRP78下游的信号分子，正常情况下，胞内CHOP表达十分低。当内质网应激时，其表达明显增加［G］。资料显示，内质网应激诱导剂thapsigargin和tunicamycin均可使CHOP表达上调，促进凋亡；对原代培养的大鼠心肌微血管内皮细胞，进行缺氧/复氧损伤，CHOP表达升高，细胞凋亡增加；而缺氧预适应则通过下调CHOP表达，减少缺氧/复氧引起的细胞凋亡[12]。郑胜哲等［13］研究发现，CHOP在大鼠脑缺血再灌注后大量表达，使用RNAi技术沉默CHOP后，大鼠脑损伤区TUNEL染色阳性细胞明显减少，梗死体积也有所缩小，说明CHOP在脑缺血再灌注后起到了介导细胞凋亡加重脑损伤的作用。朱海英等［14］发现，随着大鼠脑缺血再灌注损伤加重，CHOP被大量激活，CHOP与Caspase-12共同作用，促进内质网应激进展，加速细胞凋亡的级联反应，起到促进脑细胞凋亡的作用。目前关于CHOP的凋亡通路，可能通过下调Bcl-2水平、上调Ero-1水平以及目靶基因TRB3介导细胞凋亡。杜锡潮等［15］在CCl4致大鼠肝纤维化中发现CHOP和TRB3在肝纤维化过程中蛋白及mRNA表达水平明显增加，其变化趋势与大鼠肝细胞凋亡率一致，提示内质网应激可能通过CHOP和TRB3促进凋亡，参与肝纤维化发生发展。但CHOP、TRB3与脑缺血再灌注后细胞凋亡的关系研究鲜见报道。因此本研究重点观察大鼠脑缺血再灌注损伤过程中内质网应激相关信号分子GRP78、CHOP和TRB3表达的变化，探讨其在脑缺血再灌注损伤发生机制中的可能作用。1材料1.1动物材料与方法清洁级雄性SD大鼠40只，体重200±25g，贵阳医学院实验动物中心提供。1.2药品和主要试剂（1）GRP78多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；（2）CHOPⅠ抗和β-ActinⅠ抗（CellSignaling公司，美国）；（3）TRB3Ⅰ抗（北京博奥森生物技术有限公司，北京）；（4）TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；（5）逆转录试剂盒（Fermentas公司，美国）。（6）预染蛋白Marker（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；（7）PMWestenMidview荧光Marker（康为世纪生物技术有限公司）；（8）PVDF膜（MILLIPORE，美国）；（9）1.5MTris-HCl，PH8.8，制作分离胶缓冲液（Bio-Rad，美国）；（10）