grsf1介导mir346上调htert表达的作用与机制研究-study on the role and mechanism of grsf 1 - mediated mir 346 upregulating htert expression.docxVIP

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。本论文属于保密，年解密后适用本授权书。不保密√。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日中文摘要【目的】微小RNA(microRNA,miRNA)是近十几年来研究最广泛、最明确的一类大小约22nt、内源性的小非编码RNA分子。其经典的作用机制是成熟的miRNA组装进入RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，种子序列依据与靶基因mRNA非翻译区的配对程度决定mRNA降解还是翻译抑制，从而在转录后水平调节基因的表达。但是，最近的研究发现，miRNA还可以在转录和转录后水平上调基因的表达，这依赖于miRNA与靶mRNA序列的特异性相互作用，并且与miRNA核糖核蛋白复合体(microribonucleoprotein,microRNP)的具体成分及细胞的功能状态密切相关。另外，miRNA参与的调控网络是复杂的，既可以通过一个miRNA调控多个靶基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合精细调控一个靶基因的表达。本实验室前期工作发现，在宫颈癌细胞中，miR-138靶定人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)mRNA3’UTR并负性调控其表达，抑制细胞的生长；miR-346靶定并上调hTERT的表达，促进细胞的生长，并且miR-138和miR-346靶定hTERTmRNA3’UTR的同一区域，二者竞争调控hTERTmRNA，维持其异常高表达水平。本课题在此基础上着重阐明miR-346结合hTERTmRNA3’UTR上调其表达的分子机制。【方法】首先，宫颈癌细胞HeLa经放线菌素D(actinomycinD,ActD)处理之后用定量PCR(qRT-PCR)实验检测hTERTmRNA的表达水平，确定miR-346在转录水平还是转录后水平调控hTERTmRNA的表达。然后，用RNAhybrid软件预测miR-346/hTERTmRNA二聚体的可能二级结构，深入分析miR-346的模序；生物信息学预测miR-346的其它候选靶基因，并预测与这些候选靶基因形成二聚体后miR-346暴露的模序结构，分别选取与miR-346杂交后暴露和不暴露类似miR-346/hTERTmRNA中miR-346模序的两个靶基因。利用荧光报告载体实验、qRT-PCR和westernblot实验分别研究miR-346对hTERT的调控是否受AGO2的影响、模序突变型miR-346对hTERT表达调控的影响以及miR-346对ACVR2B表达调控的影响。在HeLa细胞中用AGO2的抗体进行RNA免疫沉淀实验(RNAIP,RIP)，qRT-PCR检测AGO2复合体中miR-346和hTERTmRNA的富集水平。同时，利用MTT实验和平板克隆形成实验检测模序突变型miR-346对细胞活性和生长能力的影响。之后，将miR-138/hTERTmRNA二级结构中暴露出的“UGAA”模序I突变为野生型miR-346的“CCGCAU”模序或突变型“AAAAUA”模序，westernblot实验检测突变型miR-138对hTERT蛋白表达的影响。接下来，在HeLa细胞中单独改变GRSF1或同时改变GRSF1和野生型或模序突变型miR-346的表达水平，westernblot实验检测hTERT蛋白或ACVR2B蛋白表达水平的改变，从而分析GRSF1在miR-346上调hTERT和ACVR2B表达过程中的作用。随后，利用RIP实验和RNA凝胶电泳迁移实验(Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)实验验证GRSF1与miR-346和/或hTERTmRNA的相互作用。进一步地，用蔗糖密度梯度离心实验分离和纯化核糖体，qRT-PCR检测核糖体组分中miR-346和hTERTmRNA的富集程度，分析miR-346是否募集hTERTmRNA到核糖体以及该过程是否由GRSF1介导。【结果】miR-346延长hTERTmRNA的半衰期，增强hTERTmR