grim 19诱导子宫颈癌细胞中p53蛋白积聚的机制研究-mechanism of grim19 inducing p53 protein accumulation in cervical cancer cells.docxVIP

基因，是Kalvakolanu用反义RNA敲除技术在乳腺癌细胞中筛选鉴定并首先报道的凋亡蛋白。Grim-19属GRIMs家族成员，是参与细胞线粒体的呼吸作用和调控细胞凋亡的新基因，定位于19p13.2，该区的多种基因为前列腺癌的抑制基因。编码含144个氨基酸残基的蛋白质，分子量约16kD，表达于人体多种正常组织中，主要定位在线粒体，细胞核也有少量表达。研究发现GRIM-19的表达促进了细胞的凋亡，其表达降低或位点突变可以导致细胞的异常增殖和恶性转化。许多肿瘤中，如甲状腺肿瘤、肾癌、口腔癌、结直肠癌等中均发现GRIM-19表达的降低。STAT3在许多肿瘤中处于持续激活状态，是肿瘤治疗的新靶点。目前研究认为GRIM-19是STAT3表达和激活的负性调节子，GRIM-19与其结合后，抑制其激活引起的下游基因的转录。但是GRIM-19在子宫颈癌细胞发生、发展中所发挥的具体作用尚不清楚。本课题组率先对子宫颈癌细胞中GRIM-19的表达及功能进行了相关研究。研究发现，子宫颈癌组织中GRIM-19表达显著降低，建立稳定表达GRIM-19的HeLa细胞株，命名为HeLa/GRIM-19细胞，体内体外实验中均证实，GRIM-19具有抑制STAT3活性，阻滞细胞生长，促进细胞凋亡的重要作用。鉴于之前研究结果已确定子宫颈癌组织中GRIM-19表达降低，且GRIM-19具有抑制子宫颈癌细胞生长，促进其凋亡的作用；而p53蛋白在子宫颈癌的发病机制中具有重要抗肿瘤、促细胞凋亡作用。因此，我们探讨了子宫颈癌细胞中GRIM-19对p53基因表达的影响。发现，GRIM-19表达的恢复具有诱导p53蛋白积聚的作用，并且积聚的p53蛋白具有抑制子宫颈癌细胞增殖的功能。目的研究GRIM-19对p53基因表达的影响及分子机制，为子宫颈癌的治疗提供理论依据及治疗线索。方法⑴采用WesternBlot方法检测瞬时转染pGRIM-19后子宫颈癌细胞株HeLa细胞中p53及下游靶基因p21、PUMA的蛋白表达；⑵使用siRNA沉默GRIM-19后，采用WesternBlot方法检测子宫颈癌细胞株HeLa细胞中p53及下游靶基因p21、PUMA的蛋白表达；⑶采用WesternBlot方法检测瞬时转染pGRIM-19后子宫颈癌细胞株SiHa、CaSki细胞中p53及下游靶基因PUMA的蛋白表达；⑷使用siRNA沉默GRIM-19后，采用WesternBlot方法检测子宫颈癌细胞株SiHa、CaSki细胞中p53及下游靶基因PUMA的蛋白表达；⑸采用WesternBlot方法检测瞬时转染pGRIM-19或GRIM-19siRNA后卵巢癌细胞株HO8910细胞中p53蛋白的表达；⑹使用Thymidine同步化后，采用流式细胞仪检测稳定表达GRIM-19的HeLa细胞周期的变化；⑺采用FQ-PCR方法检测瞬时转染pGRIM-19后HeLa细胞中p53mRNA的表达；⑻采用报告基因检测瞬时转染pGRIM-19后HeLa细胞中p53启动子的激活情况；⑼使用siRNA沉默STAT3后，采用WesternBlot检测HeLa、SiHa细胞中p53蛋白的表达；⑽采用WesternBlot检测瞬时转染STAT3C及STAT3DN后子宫颈癌细胞株HeLa、SiHa细胞中p53蛋白的表达；⑾使用CHX处理后采用WesternBlot检测稳定表达GRIM-19的HeLa细胞中p53蛋白半衰期的变化。结果⑴WesternBlot检测结果显示瞬时转染pGRIM-19后HeLa细胞中p53及下游靶基因p21、PUMA的蛋白表达较对照组明显升高，差异有统计学意义，p0.05；⑵WesternBlot检测结果显示通过siRNA沉默GRIM-19后HeLa细胞中p53及下游靶基因p21、PUMA的蛋白表达较对照组明显下降，差异有统计学意义，p0.05；⑶WesternBlot检测结果显示瞬时转染pGRIM-19后SiHa、CaSki细胞中p53及下游靶基因PUMA的蛋白表达较对照组明显升高；⑷WesternBlot检测结果显示通过siRNA沉默GRIM-19后SiHa、CaSki细胞中p53及下游靶基因PUMA的蛋白表达较对照组明显下降；⑸WesternBlot检测结果显示瞬时转染pGRIM-19或GRIM-19siRNA后HO8910细胞中p53蛋白的表达较对照组均无明显变化；⑹流式细胞仪检测结果显示稳定表达GRIM-19的HeLa细胞周期较对照组细胞明显阻滞于G1期；⑺FQ-PCR检测结果显示瞬时转染pGRIM-19后p53mRNA表达水平较对照组则无明显变化，差异无统计学意义，p0.05；⑻报告基因检测结果显示瞬时转染pGRIM-19后p53的启动子较对照组无明显激活，差异无统计学意义，p0.05；⑼West