hbx转染小鼠细胞因子的表达及gst mig gst ip 10融合蛋白原核表达载体的构建与表达-expression of hbx transfected mouse cytokines and construction and expression of gst mig gst ip 10 fusion protein prokaryotic expression vector.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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hbx转染小鼠细胞因子的表达及gst mig gst ip 10融合蛋白原核表达载体的构建与表达-expression of hbx transfected mouse cytokines and construction and expression of gst mig gst ip 10 fusion protein prokaryotic expression vector.docx

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hbx转染小鼠细胞因子的表达及gst mig gst ip 10融合蛋白原核表达载体的构建与表达-expression of hbx transfected mouse cytokines and construction and expression of gst mig gst ip 10 fusion protein prokaryotic expression vector

【结果】1．高压水动力小鼠尾静脉注射 HBx，提取小鼠肝细胞 RNA，RT-PCR 扩增结果表明模型组肝组织中有 HBx 的表达，表明模型建立成功。2．Microarray 筛选出 611 个表达有差异的基因（ratio2 和 ratio0.5 有意义），挑选其中感兴趣的目的基因，采用实时荧光定量 PCR 建立差异基因表达谱，进一步通过 RT-PCR 扩增结果表明，4 种趋化因子表达上调，分别为 Ccl2，Ccl9，MIG 及 IP-10。3．MIG 及 IP-10 蛋白的表达：免疫组化检测小鼠肝脏中 MIG 和 IP-10 的表达，结果表明与基因水平的检查结果一致。4．IFN-γ的表达：ELISA 检测结果显示实验组 IFN-γ的表达上调，提示小鼠肝细胞转染 HBx 可诱导 IFN-γ与 MIG 和 IP-10 的表达上调。5．MIG 和 IP-10 原核表达载体的构建与表达：扩增基因经测序验证正确后克隆至 pET42a，经酶切电泳鉴定可见目的条带，表明原核表达载体构建成功。表达载体转化菌经 IPTG 诱导表达，PAGE 及 Western blot 可见目的蛋白条带，表明原核表达载体转化菌 IPTG 诱导表达产物经 GST 纯化后得到纯化的融合蛋白。6．表达蛋白趋化活性：Transwell 实验证明表达蛋白对活化的小鼠脾细胞具有趋化作用，表明 MIG 和 IP-10 融合蛋白具有生物学活性。【结论】研究结果表明：①HBx 在小鼠肝细胞可诱导趋化因子的表达，可诱导 MIG 和 IP-10 的高表达，可能参与其免疫炎症过程；②鼠 MIG 和 IP-10 原核表达载体构建成功，并获得高效表达，表达产物具有趋化活性，为进一步制备抗体，以及探讨其在 HBV 感染中的生物学效应奠定了良好的基础。【关键词】乙型肝炎病毒、HBx、microarray、趋化因子、MIG、IP-10Altered Chemokines and Cytokines Gene Expression in Hepatitis B Virus XHydrodynamicInjectionMouseModel and the constrction of mouse GST- MIG，GST-IP10recombinedprotokaryon vector【 OBJECTIVE 】AbstractTo establish a gene expression analyse of chemokines and cytokines in HBx hydrodynamic injection mouse model through microarray;To construct theplamid of pET42a-MIG 和 pET42a-IP-10 which can express fusion protein forantibody production ，thus inverstigate the potential effect of Mig and IP-10 on live disease .【 METHODS 】Establish a HBx hydrodynamic tail vein injection mouse model successfully，meanwhile，establish HBx-lacked mouse model as internal control and take the untreated mice as blank control.Liver tissue obtained from untreated and HBx hydrodynamic injection mouse were initially analysed by DNA microarray techlology and subsequently confirmed the interested up-regulated gene by quantitative realtime PCR and then verified the chemkines and cytokines by semi quantitative RT-PCR.The expression of Mig and IP-10 in liver was determined by Immunohistochemistry.Furthermore，IFN-γ，the inducer of Mig and IP-10 in liver was detected via ELISA.Construct the recombinant