hif1αbnip3beclin1信号通路介导的自噬与孕期缺氧胎鼠肾发育障碍的机制研究-study on the mechanism of autophagy mediated by hi f1 α bnip 3 be clin 1 signal pathway and renal development disorder in fetal rats with hypoxia during pregnancy.docxVIP

患者肾及肾单位发育落后的原因之一。自噬是否也参与了这一过程国内外尚未有报道。自噬激活过程，往往与凋亡共存或同时发生。一个突破性的研究表明凋亡抑制分子BCL-2可以通过与自噬的标记物之一Beclin-1相互作用，进而对自噬发挥作用。自噬在孕期缺氧大鼠肾单位发育的作用及其机制目前国内外都未见报道。因此，进一步论证自噬与肾单位发育的关系，深入分析其分子调控机制就显得十分必要。PI3K/Akt/mTOR和HIF-1α/BNIP3/Beclin-1是细胞低氧条件下发生自噬上调的二条重要信号通路。本课题对此二条信号通路是否参与了孕期缺氧诱导的肾发育障碍的肾细胞的损伤进行初步的研究。为探讨孕期缺氧对胎鼠肾脏发育落后的机制，本实验利用大鼠及大鼠肾细胞株（NRK-52E），分别从整体、组织器官、细胞、分子水平，就孕期缺氧诱导的自噬对胎鼠肾脏发育的影响及自噬信号通路进行了研究。第一部分孕期缺氧对胎鼠形态学、血气及肾脏发育和功能的影响目的：观察孕期缺氧对胎鼠形态学的影响，以及对肾脏发育和功能的影响。方法：孕鼠从妊娠第4天至第21天（GestationDay，GD4-21）置缺氧箱（常压低氧，O2浓度为10.5%），建立LBW动物模型。缺氧期间每天称量孕鼠饮食量及体重，计算体重增长量。于GD21天，以剖宫术取胎鼠。以正常胎鼠做对照，测量胎鼠（GD21）的身长、尾长，称量胎鼠体重、脏器如心、肝、肺、肾和脑等重量；用血气分析仪检测胎鼠血气指标；用酶标法分析胎鼠血液中尿酸（UricAcid,UA）、血尿素氮（BloodUreaNitrogen,BUN）、肌酐（Creatinine,CRE）含量；分别对上述样本肾脏组织进行HE染色，光镜观察组织结构；电镜观察胎鼠肾脏的超微结构。结果：与对照组相比，孕期缺氧对孕鼠饮食量有一过性影响、对体重增长量无明显影响，但可显著降低胎鼠的体重、肾量、心重、肝重、肺重及肾重指数、肝重指数；明显降低胎鼠血液中pO2、SO2%水平。组织形态学结果显示孕期缺氧可使胎鼠肾间质增生、肾囊腔增宽、肾小球固缩；足细胞足突分支减少且变低平，线粒体肿胀变形，嵴固缩。结论：孕期缺氧导致胎鼠及肾脏发育落后。关键词：孕期缺氧；胎鼠；肾脏；发育落后HIF-1α/BNIP3/Beclin-1信号通路介导的自噬与孕期缺氧胎鼠肾发育障碍的机制研究中文摘要第二部分孕期缺氧诱导IUGR胎鼠肾脏自噬及凋亡的机制研究目的：探讨孕期缺氧对胎鼠肾脏自噬及凋亡程度的影响；研究孕期缺氧调控自噬及凋亡的信号通路。分析凋亡及自噬与孕期缺氧诱导的肾发育障碍的相关联系。方法：用放免法检测IUGR胎鼠肾脏组织中可溶性抗凋亡蛋白及自噬相关蛋白；用透射电镜法观察实质细胞中自噬结构的改变；用免疫印迹法检测肾脏组织中凋亡相关蛋白、自噬标记蛋白以及自噬通路、凋亡通路关键蛋白；采用real-timePCR法检测缺氧后肾脏组织LC3mRNA的表达水平。TUNEL染色法检测肾脏细胞发生凋亡的程度。结果：孕期缺氧可导致胎鼠肾脏组织APG5L含量增加，而sFAS无显著变化。孕期缺氧可使肾细胞中自噬小体及自噬溶酶体等自噬结构显著增加，自噬活性增加。与对照组相比，缺氧组自噬相关蛋白LC3-II表达明显增加，而LC3-I表达无明显变化，LC3-II/LC3-I显著增高；p62及BCL-2蛋白表达明显减少。缺氧胎鼠肾脏中的自噬通路关键蛋白Beclin-1,p-S6,HIF-1α表达增加，而AKT及p-AKT含量减少。TUNEL染色阳性细胞缺氧组明显多于对照组。结论：孕期缺氧引起胎鼠肾脏组织中自噬上调及自噬活性增加。激活自噬的机制可能是HIF-1α/BNIP3/Beclin-1通路的激活，而与PI3K/Akt/mTOR通路关系不大。细胞凋亡增加的可能机制是抑制BCL-2信号通路而激活了caspase-3信号途径，与sFas/FasL信号受体途径无关。关键词：孕期缺氧；自噬信号通路；蛋白表达；凋亡第三部分低氧对NRK-52E细胞自噬的影响目的：观察低氧对NRK-52E细胞的生长以及自噬程度的影响；探讨自噬在低氧环境下对细胞存亡的影响。方法：首先常规培养NRK-52E细胞，通过倒置显微镜下观察细胞生长及细胞计数，绘制生长曲线图，探索NRK-52E细胞的增殖期，明确NRK-52E细胞进行药物干预的最佳时间；通过western-blot法检测不同浓度3-MA干预后对自噬标记蛋白表达水平影响程度，确定药物干预的最适药物浓度。在最适时机用最佳3-MA药物浓度干预后，用免疫印迹法检测LC3、Beclin1及p62的蛋白表达水平，推测低氧对细胞自噬及其活性的影响；通过MTT法及LDH法分别检测细胞存活率及乳酸脱氢酶漏出率的检测，分析低氧诱导的自噬对细胞存亡的影响。通过使用三气培养箱的使用建立NRK-52E细胞缺氧模型，应用自噬抑