卵转铁蛋白的分离纯化 结构表征及体外抗菌分析-isolation, purification, structural characterization and in vitro antibacterial analysis of ovotransferrin.docxVIP

卵转铁蛋白的分离纯化、理化性质与结构表征及体外抗菌研究摘要卵转铁蛋白具有重要的生物活性功能，比如铁传递、抗菌性、及抑制游离基的 形成等。鸡蛋清中卵转铁蛋白的含量比较丰富(12％)，但关于蛋清中卵转铁蛋白分 离纯化的研究进展却相对较为缓慢。本文采用超滤和离子交换层析两种方法分别对鸡蛋清中的卵转铁蛋白进行分 离纯化，分离纯化卵转铁蛋白的过程中分别研究了不同因素对纯化效果的影响，并 进行优化；然后研究了分离纯化得到卵转铁蛋白的理化性质及结构表征；研究了卵 转铁蛋白体外抗菌活性。主要研究结果如下：1．采用超滤法分离纯化卵转铁蛋白，研究了前处理对降低蛋清液黏度的影响， 发现稀释倍数为15倍、剪切速率为7 kr／min、温度为45℃时蛋清液黏度适宜。同 时，对超滤过程中的工艺条件进行研究，其中物料的稀释倍数15倍、搅拌速率125 r／min、操作压力O．15 MPa及pH值为7。在单因素的基础上，选取操作压力、稀释 倍数、搅拌速率三个因素进行正交试验，对超滤过程中的最佳工艺条件进行优化， 优化得到的最优组合为A382C2，由于最优组合不在正交表组合内，通过验证试验比 较最优组合A382c2和L9(34)表内最优组合A382Cl，确定最优组合为A382C2，即 操作压力为0．15 MPa，稀释倍数为10倍，搅拌速率为125 r／min。最后通过SDS．PAGE 凝胶电泳和HPLC对分离得到的卵转铁蛋白进行了鉴定及纯度分析，证实分离得到 的蛋白质为卵转铁蛋白，纯度为29．6％。2．在两步层析法分离纯化蛋清中卵转铁蛋白时，卵转铁蛋白先分别用40％饱和 度和80％饱和度的硫酸铵进行分级盐析，然后用Q．Sepharose Fast Flow离子交换树 脂进行两步层析，第一步层析除掉大部分溶菌酶和抗生物素蛋白，第二步层析用pH 8．5 0．08 mol／L NaCl进行洗脱，通过SDS．PAGE电泳进行鉴定，确定了收集到的洗 脱峰3为卵转铁蛋白。通过HPLC得知分离得到的卵转铁蛋白的纯度为98．3％。3．研究了卵转铁蛋白铁离子的结合能力，及各种因素对铁离子结合能力的影 响。在pH 5—9的Tris．H3804缓冲液中，发现在中性和偏碱性的条件下，卵转铁蛋 白的铁结合能力比较高；加入浓度分别为0，40，80，120，160 mmol／L的碳酸氢 钠后发现120 mmol／L的HC03-浓度对铁离子的结合较为有效；将卵转铁蛋白置于华中农业大学2011届硕士研究生学位论文55C、60‘C、65℃下分别保温30rain，70℃下毛细管保温20 8，快速冷却到25C， 测定铁结合能力，研究发现60C下低温杀菌能保持卵转铁蛋白的铁结合能力：通 过圆二色谱分析发现不同铁饱和度卵转铁蛋白随着铁饱和度的增加，a．螺旋有所升 高，p-折叠相应的减小，p一转角稍有增加，无规卷曲减少，可能是由于随着铁饱和 度的增加，卵转铁蛋白伸展的空间结构变的收缩起来。通过ANS荧光探针法测得 卵转铁蛋白表面疏水性指数为70．35。Zeta电位和平均粒径测定表明铁饱和度增加 后，带正电荷的铁离子与带负电荷的卵转铁蛋白氨基酸残基结合更为紧密，使原 本伸展的蛋白质空间结构变得紧密起来，有利于提高蛋白质的乳化性。通过 ARl000流变仪测得卵转铁蛋白凝胶的临界质量分数为20％。4．卵转铁蛋白的体外抑菌试验表明：其对大肠杆菌、沙门氏菌有较好的抑制效 果，在较高浓度下对金黄色葡萄球菌也有一定的抑制作用，对三种菌的最小抑菌浓 度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为：大肠杆菌为2．5 mg／mL和10．0 mg／mL，沙 门氏菌为5．0 mg／mL和15．0 mg／mL，金黄色葡萄球菌为3．5 mg／mL和12．5 mg／mL。 卵转铁蛋白对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果随铁饱和度的增加而降低，相对于其它金属结合铁时卵转铁蛋白的抑菌效果较好。 卵转铁蛋白能够提高机体免疫能力，增强机体抗病防病的能力，同时对预防贫血等具有很重要的意义。母乳喂养的婴儿对肠道细菌的抵抗能力比奶粉喂养的要 强，某种程度上是由于母乳中含有较多的乳铁蛋白。由于卵转铁蛋白和乳铁蛋白具 有相似的结构和功能，并且临床证实婴JL／]艮用后并无异源蛋白常有的过敏等不良反 应(Francesco Giansanti et al，2001)。卵转铁蛋白作为生物功能产品开发具有广阔的前 景。关键词：鸡蛋，蛋白质，卵转铁蛋白，纯化，抗菌活性Ⅱ卵转铁蛋白的分离纯化、理化性质与结构表征及体外抗菌研究Abs仃actOvotransferrin have important physiological functions，such觞Fd+transferrin, antimicrobial properties，inhibit the