镰刀菌几丁质合成酶chs1和chs2基因小片段rna干扰功能分析-analysis of rna interference function of small fragments of fusarium chitinase ch s1 and chs 2 genes.docxVIP

研究生优秀毕业论文镰刀菌几丁质合成酶Chsl和Chs2基因小片段RNA干扰功能分析目录摘要．．iA】BSTRACT．．．． ．． ．．． ． ．． ．．．． ．． ．． ． ． ． ．．．ii缩略表iii1前言11．1镰刀菌研究概况．．11．1．1赤霉病11．1．2禾谷镰刀菌11．1．3禾谷镰刀菌在小麦穗部的侵染过程11．2真菌细胞壁．．21．2．1真菌细胞壁的组成及结构21．2．2几丁质合成酶的分类与结构31．2．3几丁质合成酶的生物学功能41．3 RNAi技术41．3．1 RNAi技术的发现一41．3．2 RNAi的特点一51-3．3 RNAi作用机制．．61．4丝状真菌中与I矾Ai相关的基因沉默．．61．4．1 RNA压制(quelling)一61．4．2非配对DNA诱导的减数分裂沉默现象．71．4．3真菌中的小RNA71．5真菌RNAi研究路线．．81．5．1转化的方法81．5．2 RNAi发卡结构表达载体应用．．81．5-3 RNAi双启动子系统的应用一91．6研究的目的及意义一92实验材料与方法102．1实验材料102．1．1真菌菌株．．102．1．2小麦材料．．102．1．3质粒载体．．102．1．4试剂及培养基．．102．1．5主要仪器设备．．1 3万方数据华中农业大学201 5届硕士研究生学位(毕业)论文2．2实验方法132．2．1 PCR扩增 132．2．2 Gateway反应步骤 142．2．3感受态细胞制备及转化 142．2．4质粒DNA的提取 152．2。5质粒DNA的提取试剂盒回收DNA片段 ．162．2．6原生质体的制各及转化 162．2．7转化子PCR检测 ．172．2．8转化子Southern blot分析 l 82．2．9转化子产孢能力分析和分生孢子形态大小的比较 192．2．10压力敏感性分析 ．192．2．11几丁质含量分析 ．192．2．12转化子田间花期单花接种 ．203结果与分析213．1几丁质合成酶(Chsl)小片段功能分析和鉴定213．1．1基因序列比对 213．1．2目的片段的扩增 213．1．3 pSXSH．RNAi—Chsl系列干扰表达载体的构建 ．213．1．4导入Chsl小片段RNAi载体菌株的筛选与鉴定 ．22 3．1．5导入Chsl小片段RNAi载体菌株southern blot鉴定 ．．24 3．1．6 Chsl小片段RNAi真菌菌株对不同外界压力的敏感性分析 一253．1．7 Chsl小片段RNAi真菌菌株产孢量和分生孢子形态大小的分析 ．．263．1．8 Chsl小片段RNAi真菌菌株致病力分析 ．．273．1．9 Chsl小片段RNAi真菌菌株几丁质含量的测定分析 ．．283．2几丁质合成酶(Chs2)小片段功能分析和鉴定293．2．1基因序列比对 293．2．2目的片段的扩增 293．2．3 pSXSH．RNAi．Chs2系列干扰表达载体的构建 ．303．2．4导入Chs2小片段RNAi载体菌株的筛选与鉴定 ．3 1 3．2．5导入Chs2小片段RNAi载体菌株southern blot鉴定 ．．33 3．2．6 Chs2小片段RNAi真菌菌株对不同外界压力的敏感性分析 ．．333。2．7 Chs2小片段RNAi真菌菌株产孢量和分生孢子形态大小的分析 一343．2．8 C办妇小片段RNAi真菌菌株致病力分析 ．．353．2．9 Chs2小片段RNAi真菌菌株几丁质含量的测定分析 ．．364．讨{仑．38万方数据镰刀菌几丁质合成酶ChsI和Chs2基因小片段RNA干扰功能分析参考文献40附录．．47致谢．．48III万方数据镰刀菌几丁质合成酶Chsl和Chs2基因小片段RNA干扰功能分析摘要小麦赤霉病(Fusarium Head Blight，FHB)是由镰刀菌(Fusarium)引起的一种 世界性真菌病害。小麦作为世界第二大粮食作物，缺乏对赤霉病的天然抗性，易造成大规模的赤霉病害的爆发，导致产量的大幅下降甚至颗粒无收。因此需要一种有 效的方法来增强小麦对赤霉病的抵抗力。RNAi技术的出现对小麦抗性的提高提供了 一个新思路。几丁质是一种真菌细胞壁的重要组成成分，是由几丁质合成酶(chitinsynthases，Chs)催化合成的，病原真菌通常含有多个几丁质合成酶基因，而植物中 未发现几丁质合成酶的存在，因此几丁质合成酶是抗真菌药物的理想靶标。本研究 利用Gateway技术构架了不同的几丁质合成酶(Chsl，Chs2)基因小片段的RNAi表达载体，通过RNAi技术筛选出对亚洲镰刀菌生长发育和致病力影响较大的基因 小片段，为小麦的抗病改良提供材料。1．将几丁质合成酶(