抗人类成纤维细胞生长因子受体2fgfr2)的单链抗体的筛选-screening of single chain antibodies against human fibroblast growth factor receptor 2 fgfr 2 ).docxVIP

摘要人类成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）及其配体在胚胎发育及组织生长中都扮演着重要的角色，对细胞的增殖、分化、迁移等都有着重要的作用。FGFR2-Ⅲb亚型在上皮细胞中表达,有证据表明FGFR2-Ⅲb的过量表达与癌症发展相关。本课题研究的主要内容是通过酵母双杂交技术从一个单链抗体（Single-ChainVariableFragment，scFv）文库中筛选出能与FGFR2-Ⅲb胞外段相互作用的scFv，并准备利用哺乳动物双杂交方法进一步验证两者的相互作用。从而为抑制有FGFR2过量表达的肿瘤细胞的增殖以及癌症治疗奠定一定的基础。本课题的研究主要包括以下几个方面:（1）从Genbank中查询FGFR2-Ⅲb基因并获得能与FGFs结合的胞外段cDNA序列信息，由公司合成cDNA后，将cDNA连接到酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中，形成pGBKT7-FGFR2；（2）将pGBKT7-FGFR2质粒转化酵母细胞AH109；（3）扩增含有单链抗体cDNA的猎物质粒文库pSF50-scFv以及提取文库质粒；（4）将单链抗体文库转化入已含有pGBKT7-FGFR2的AH109，进行酵母双杂交实验；（5）提取阳性AH109克隆的质粒，转化大肠杆菌DH5α，在氨苄青霉素平板上生长，从而获得带有pSF50-scFv的DH5α，提取pSF50-scFv质粒，对阳性克隆的scFvDNA测序并分析和比较抗体片段的DNA序列；（6）将阳性克隆的scFvDNA回转入已含有pGBKT7-FGFR2质粒的AH109，进一步验证两者的相互作用；（7）设计引物将FGFR2胞外段扩增后连接至哺乳动物双杂交质粒pACT内,设计引物将阳性pSF50-scFv的scFv片段扩增后连接至哺乳动物双杂交质粒pBIND内，为进行哺乳动物双杂交实验做准备，以验证FGFR2与筛选得到的scFv在哺乳动物细胞中的相互作用。本课题经过酵母双杂交得到18个scFv阳性克隆，通过DNA测序和分析表明有9个不同的阳性克隆，FGFR2和9种通过酵母双杂交筛选所得的scFv片段已克隆至相应的哺乳动物双杂交质粒pACT和pBIND中形成pACT-FGFR2和pBIND-scFv，为即将展开的下一步检测做好准备。关键词：FGFR2；癌症；scFv；酵母双杂交；哺乳动物双杂交AbstractFibroblastgrowthfactorreceptor2（FGFR2）anditsligandsplayanimportantroleinembryonicandtissuedevelopmentandgrowth,andhavesignificantfunctionsoncellproliferation,differentiationandmigration.FGFR2-Ⅲbisexpressedinepithelialcells,andover-expressionofFGFR2-Ⅲbisassociatedwithsomecancers.Thisstudyusedyeasttwohybridsystemtofindsingle-chainvariablefragments（scFv）whichinteractedwithFGFR2byscreeningascFvlibrary,andtheinteractionbetweenFGFR2andscFvwillbeconfirmedbymammaliantwohybridsystem.scFvcouldbeusedtoinhibitthegrowthofcancercellswhichover-expressFGFR2andinhibitcancerdevelopment.Thisthesisincludesthefollowingsteps:(1)TheextracellulardomaincDNAsequenceofFGFR2wasfoundinGenbank,andthecDNAfragmentwassynthesizedbyabiotechnologycompany.ThencDNAfragmentwasclonedintopGBKT7plasmid;(2)YeaststrainAH109wastransformedwithpGBKT7-FGFR2plasmid;(3)scFvlibrarywasamplified,andthelibraryplasmidwasextracted;(4)ThelibraryplasmidwasusedtotransformAH109whichalreadycontainedpGBKT7-FGFR2plasmidforyeasttwohybridscreening;(5)Theplasmidofpositive