蓝藻色素蛋白的生物合成及应用分析-biosynthesis and application analysis of cyanobacteria pigment protein.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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蓝藻色素蛋白的生物合成及应用分析-biosynthesis and application analysis of cyanobacteria pigment protein.docx

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蓝藻色素蛋白的生物合成及应用分析-biosynthesis and application analysis of cyanobacteria pigment protein

或 cpcB）在大肠杆菌体内共表达，产生了色素蛋白 PVB-PecA 、 PUB-PecA 、PCB-CpcB(C-84)、PCB-CpcB(C-155)、PEB-CpcB(C-84)和 PEB-CpcB(C-155)。其光谱特征与简化前基本一致。通过荧光显微镜的观察，可以看到不同颜色、明亮的荧光细胞。藻胆色素蛋白的优点是具有较高的荧光量子产率，但也有非常明显的缺陷，即它的合成不仅需要色素合成酶、还需要裂合酶的参与。最近，蓝细菌光敏色素的研究已经有了一些进展，它的 GAF 结构域能够自催化的结合各种色素，包括 PΦB、BV、PCB、甚至 PVB，这比藻胆蛋白作为可基因编码的荧光探针具有更大的优点。本论文把实验室已有的来自于 Synechocystissp. PCC 6803 中的基因 slr1393的一个 GAF 结构域编码基因 gaf3 与色素合成酶基因进行大肠杆菌体内共表达，产生了色素蛋白 PCB-GAF3 和 PΦB-GAF3。光谱分析表明，它们是红色、远红色荧光蛋白，最大荧光值到达 670nm 和 690nm，并且具有独特的红绿光转换的可逆光致变色效应。尽管 GAF 自催化结合色素，但是仍然需要色素合成酶基因共表达，而 GFP 作为荧光蛋白，不需要其他的辅助因子。因此，本论文采用首尾相连、逐步融合基因的方法解决了这个问题。ho1和 pcyA先融合成一个基因编码框 ho1:pcyA，然后 gaf3插入融合基因 ho1:pcyA的 5’末端。构建的融合基因 gaf3:ho1:pcyA插入表达载体后可直接诱导表达，产生的色素蛋白 PCB-GAF3:HO1:PcyA 与 PCB-GAF3 具有相同的光谱特征，包括独特的可逆光致变色效应。这些结果通过光谱分析、荧光显微镜技术、 PVA 复合膜实验得以证实。当用藻胆蛋白编码基因 apcA 代替 gaf3 时，也能产生荧光色素蛋白 PCB-ApcA:HO1:PcyA，这说明融合基因的方法具有普遍的意义。色素荧光蛋白优异的光谱性质是 GFP 家族荧光蛋白的很好补充，尤其是它具有的红色荧光和可逆光控开关效应将为组织深度成像、超分辨显微技术、甚至三维数据存储技术提供便利。关键词：藻胆蛋白裂合异构酶蓝细菌光敏色素荧光色素蛋白融合基因GAF 结构域可逆光致变色AbstractCyanobacteria is the photosynthesis microorganism. Phycobilisomes are main light-harvesting complexes. Phycobiliproteins are the function composition of the complexes in the algae photosynthesis. Biosynthesis research of phycobiliprotein is of great significance, contributing to the understanding of the structural basis and the biochemical mechanism of cyanobacteria photosynthesis, which can complete the assembly of the phycobilisomes, and also providing the necessary conditions for biosynthesis in vitro of these fluorescent biliproteins. By heterologous recombination in vivo in E. coli, the thesis confirmed that CpeY/Z or CpeY can catalyze covalent attachment of PEB to CpeA of PEIs from Synechococcus sp. Strain WH8102, and PEB-CpeA has a higher yield under catalysis of CpeY/Z, but neither CpeY/Z nor CpeY catalyze covalent attachment of PEB or PUB to MpeA of PEIIs. Further experiments found that the lyases MpeU, MpeY and so on didn’t catalyze the attach