类芽孢杆菌bg1种的鉴定及其抗菌蛋白的分析-identification of bacillus - like bg1 and analysis of its antibacterial protein.docxVIP

类芽孢杆菌 Bg1 种的鉴定及其抗菌蛋白的研究摘要尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是多种植物重要的维管束病害，病原菌多为 引起系统性侵染、土壤传播的病害。其多个专化型能引起甘蓝、香蕉、番茄和瓜类等 植物的枯萎病，在生产上的危害十分严重。目前利用生物防治来控制病害是安全、有 效的措施之一。类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）由于能产生丰富的抗菌物质，是植物 病害的有效的生防菌株。本实验是在刘霞初步将 Bg1 定为类芽孢杆菌属（Paenibacillus sp.）工作的基础上开展工作。通过生理生化实验及 DNA-DNA 杂交等分子生物学技 术，确定了生防菌株 Bg1 的分类地位；对类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）Bg1 抗菌蛋 白的分离纯化和结构鉴定，明确菌株 Bg1 对甘蓝枯萎病菌的抑制作用，为明确生防 菌株 Bg1 的抑菌机理提供了理论依据和利用该菌株开发生物农药奠定了基础。通过 16SrDNA、ropB 基因序列分析和系统进化树分析、G+Cmol%含量测定、与 相近菌株的生理生化比较分析、脂肪酸含量测定以及 DNA-DNA 杂交分析，对类芽 孢杆菌 Bg1 进行了种的鉴定。菌株 Bg1 与 Paenibacillus elgii SD17T、Paenibacillus ehimensis EAG5T 的 16SrDNA 同源性均为 99%；ropB 实验结果表明菌株 Bg1 与 P.elgii SD17T 的同源性为 99%，与 P.ehimensis EAG5T 同源性为 89%；菌株 Bg1 与 P.elgii SD17T、P.ehimensis EAG5T 生理生化特征不吻合的项目较多；菌株 Bg1 的脂肪酸组成 与 P.elgii SD17T 有四项不一致，而与 P.ehimensis EAG5T 有五项不一致；DNA-DNA 杂交结果显示菌株 Bg1 与 P.elgii SD17T 有最高基因组相似性，为 80.17±2.77%，而与 P.ehimensis EAG5T 基因组相似性仅为 25±2.68%。综合以上实验结果将菌株 Bg1 确定 为埃吉类芽孢杆菌（Paenibacillus elgii）。使用 60%硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A50 离子交换层析及 Sephadex G100 凝胶 过滤层析对菌株 Bg1 的抗菌蛋白进行了分离纯化，以 SDS对该抗菌蛋白进行 了纯度检测，以肽质量指纹图谱和 MALDI-TOF-TOF-MS/MS 对该抗菌蛋白进行了结 构鉴定。Bg1 无菌发酵滤液经三步纯化后得具有抑菌活性的单一电泳条带蛋白组分， 其分子量约 10 KD。质谱结果表明，Bg1 产生的活性蛋白都是一些水解的小分子肽。 类芽孢杆菌 Bg1 主要抗菌活性物质为低分子量抗菌蛋白，其对环境因子稳定性较好， 具有进一步开发应用的潜能。使用菌株 Bg1 的发酵液测定其对甘蓝枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. Conglutinans） 孢子萌发和生长的影响。通过平板对峙实验，测定菌株 Bg1 对甘蓝枯萎病菌菌落和 菌丝的影响。结果表明，Bg1 发酵液对孢子的萌发和菌落的生长均有显著的影响，发 酵液有效抑制浓度均为 4 倍，对孢子的抑制率在 88%以上；Bg1 菌落与甘蓝枯萎病菌 菌落之间形成明显的抑菌条带，且菌株 Bg1 使甘蓝枯萎病菌菌丝明显的膨大、变形I等。在利用抑菌圈法测定菌株 Bg1 对甘蓝枯萎病菌的抑制实验时，在 PDA 带菌平板中加入 0.001% SDS，探讨 SDS 对 Bg1 抑菌物质的影响。结果表明，0.001% SDS 几 乎能使生防菌株 Bg1 失去抑菌活性。该实验进一步验证了菌株 Bg1 的抑菌物质主要 是蛋白质或多肽类。关键词：埃吉类芽孢杆菌（Paenibacillus elgii），DNA-DNA 杂交，种的鉴定，抗菌蛋 白，分离纯化，活性测定Species identification of Paenibacillus sp. Bg1 and overview of antifungal proteinAbstractFusarium oxysporum is an important vascular disease of many plants, most of them are systemic infection and soil-borne disease pathogens. A plurality of specialized-types of it can cause cabbage, banana, tomato and Melon Wilt which caused very serious