il-1β基因多态性、il-10基因多态性与慢性鼻-鼻窦炎相关性研究-study on the correlation between il - 1β gene polymorphism, il - 10 gene polymorphism and chronic rhinosinusitis.docxVIP

上海交通大学医学院硕士学位论文 上海交通大学医学院硕士学位论文 PAGE PAGE 6 紫外透射与凝胶成像系统 上海天能科技有限公司 电子天平 北京赛多利斯天平有限公司 超低温冰箱 SANYO 公司 UniCAP100 全自动变态反应体外定量检测系统 瑞典 PHARMACIA 公司 二、 方法 1. 标本采集 所有研究对象均禁食 12-14h，采空腹静脉血 5ml，其中 2ml 在抗凝管中混匀， 用作提取 DNA，另 3ml 待凝血后离心取上清液，保存于 4℃冰箱内，用于血清 TIgE、 Ecp 检测。 基因组 DNA 提取 2.1 取抗凝全血 150μL，加入无菌双蒸水 150μL 混匀。 2.2 加 5mol/LKI300μL，涡旋震荡 30s。 2.3 加等体积氯仿/异戊醇（24:1）600μL，涡旋震荡 30s。 2.4 12000rpm 离心 5min 后取上清液 0.6 倍体积异丙醇混匀，室温静置 5 分钟。 2.5 12000rpm 离心 5min 后沉淀以 70%乙醇洗一次，晾干后溶于 TE 中。 2.6 所提取的 DNA 经紫外分光光度计定量及检测纯度后，置-80℃保存备用。 PCR 扩增 3.1 IL-1β基因引物设计 遵照 PCR 引物设计原则，根据基因库序列号 rs16944 和 rs1143627 分别设计扩 增-511C/T 位点和-31T/C 位点的引物，-511 引物由上海英潍捷基有限公司合成，-31 引物由上海生工公司合成，引物序列见表 1。 表 1 -511C/T 位点和-31T/C 位点引物序列 SNP 引物序列 扩增片段长度（bp） rs16944（-511C/T） P1 ５＇TTCTCTGCCCCAGCCAAGAAA ３＇ P2 ５＇GAATCTTCCCACTTACAGATGGAT ３＇ 142 rs1143627（-31T/C） P1 ５＇AGAAGCTTCCACCAATACTC ３＇ P2 ５＇AGCACCTAGTTGTAAGGAAG ３＇ 239 (注：P1 为上游引物，P2 为下游引物) 3.2 PCR 扩增反应体系和反应条件 PCR 扩增 IL-1β基因-511 位点和-31 位点目的基因片段，行温度梯度、DNA 模板、 引物、Mg++、dNTP 及 Taq DNA 聚合酶浓度梯度优化条件，最终二者的 PCR 反应体系均 为 24μL（见表 2）。预先稀释好引物，按 PCR 反应体系的剂量，向 PCR 管中依次加 入各试剂，最后滴入石蜡油覆盖，短暂离心混匀。 表 2 -511 位点和-31 位点 PCR 扩增反应体系 试剂 体积（μL） 终浓度 10×buffer(Mg++) 2.5 1×buffer dNTP 0.1 200umol/L 上游引物 0.1 100nmol/L 下游引物 0.1 100nmol/L DNA 模板 3 200ng Taq DNA 聚合酶 1 1U dd H2O 17.2 二者的反应条件均为: 94℃ 预变性 5min 后，进行 35 个循环，每个循环条件为 94℃ 40sec、55℃ 40sec、72℃ 90sec，35 个循环后以 72℃ 延长 5min。PCR 扩增 结束后，用 20g/L 琼脂糖凝胶电泳观察扩增情况，并以溴乙锭染色观察 PCR 扩增情 况。 3.3 PCR 扩增产物的检测 电子分析天平上称取琼脂糖 1.6g，加入 1×TAE 缓冲液 80ml，于微波炉中加热， 使琼脂糖充分熔解，制作成 20g/L 琼脂糖凝胶。冷却到 60℃～70℃后，加入 2μL EB （溴乙锭）混匀。摆好制胶槽，插好梳子，将胶倒入制胶槽中。待凝胶完全冷却凝 固后，小心拔去梳子，将胶放入电泳槽，加入 1×TAE 缓冲液。取 8μL PCR 扩增产 物加入加样孔中，小心加样，勿穿透加样孔。接通电源，以 100V 电压，电泳 40 分 钟。电泳结束后取出凝胶，用凝胶成像分析仪进行分析，观察结果并照相。 4. 单核苷酸多态性分析 采用 PCR-RFLP 方法对 IL-1β基因－511 位点和-31 位点单核苷酸多态性进行分 析。该技术利用限制性内切酶能识别 DNA 分子的特异序列，并在特定序列处切开 DNA 分子，即产生限制性片段的特性。酶切后产物在 8％非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳， 条件为 100V 电泳 1～2h，经 0.1% AgNO3 染色，至 DNA 条带显色后观察拍照并保存。 4.1 限制性内切酶酶切 用于-511 位点酶切的限制性内切酶 AvaⅠ的酶切位置如下： 5’…C ↓ Py C G Pu G…3’ 3’…G Pu G C Py ↓ C…5’ 用于-31 位点酶切的限制性内切酶 AluⅠ的酶切位置如下： 5’…A G ↓