kca3.1在碱性环境促进高磷诱导大鼠胸主动脉平滑肌 细胞钙化的机制研究-mechanism of kca 3.1 promoting calcification of rat thoracic aorta smooth muscle cells induced by high phosphorus in alkaline environment.docxVIP

KCa3.1在碱性环境促进高磷诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞钙化的机制研究摘要目的：心血管疾病(Cardiovasculardisease，CVD)是慢性肾脏病(Chronickidneydisease，CKD）患者最常见的并发症，也是导致终末期肾病(Endstagerenaldisease，ESRD)患者死亡的首要原因。血管平滑肌细胞（Vascularsmoothmusclecells，VSMCs）向成骨样或成软骨样细胞转化从而导致的动脉血管钙化是发生心血管事件的关键步骤。ESRD患者在透析过程中使用碳酸氢盐透析液，使机体短暂的处于碱性环境。有研究发现，腹腔注射碳酸氢钠的大鼠血管钙化更加严重，但碱性环境促进血管钙化的机制并不清楚。中电导钙激活钾离子通道（Intermediate-conductanceCa2+-activatedK+channels,KCa3.1）是依赖钙激活的重要的钾离子通道，在平滑肌细胞中广泛表达，参与多种细胞调节功能，与高血压、动脉粥样硬化密切相关，因此我们推测其可能在血管钙化中着重要作用。探究KCa3.1在血管钙化的作用，为临床治疗提供新靶点。方法：1选择4周龄健康雄性SD大鼠80g-100g，通过组织贴壁法进行平滑肌细胞原代培养；选择6周龄健康雄性SD大鼠200g-250g，进行体外血管环培养。SD大鼠购自河北医科大学动物实验中心。2体外血管平滑肌细胞培养：采用组织块贴壁法培养原代大鼠主动脉平滑肌细胞，使用10mmol/Lβ-甘油磷酸制备血管平滑肌细胞钙化模型。使用10mmol/lHCl和10mmol/lNaHCO3调整培养基pH值。采用随机数字表法，将血管平滑肌细胞随机分为6组：正常pH7.4组、高磷pH7.4组、高磷pH7.7组、高磷pH8.0组、正常pH8.0组、TRAM-34干预组（在高磷pH8.0组培养基基础上加入20nmol/LTRAM-34）。体外血管环培养：将6周龄SD雄性大鼠麻醉后，无菌条件下取出胸主动脉，小心剥掉外膜、内膜后，将血管制成2mm-3mm长的血管环，分别置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，调整pH值方法、血管环分组及各组培养基情况同体外细胞培养。3茜素红染色法和邻甲酚酞络合酮比色法判断细胞钙化程度；vonKossa染色法和邻甲酚酞络合酮比色法判断血管环钙化程度。荧光探针法测定血管平滑肌细胞内钙离子浓度。RT-PCR、WesternBlot检测各组细胞中KCa3.1和调节成骨和软骨分化的关键转录因子Runx2表达，酶联免疫吸附法测定碱性磷酸酶（ALP）活性。免疫组织化学法检测各组血管环中KCa3.1、Runx2表达。4数据分析采用SPSS17.0软件分析，符合正态分布的计量资料以(x??s)表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较用S-N-K检验（Student-Newman-Keuls，SNK），相关分析符合双变量正态分布作Pearson积差相关分析。P0.05为差异有显著性。结果：1碱性环境对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化和血管环钙化的影响1.1碱性环境对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的影响：细胞培养12天后，茜素红染色和钙含量测定结果均显示：高磷组细胞钙盐沉积明显高于对照组(P0.05)，且随着pH升高钙盐沉积逐渐增加(P0.05)；而TRAM-34干预组细胞钙盐沉积明显减少(P0.05)。1.2碱性环境对高磷诱导的血管环钙化影响：血管环培养12天后，硝酸银染色显示：高磷组血管中膜棕黑色颗粒沉积较对照组显增多，且随着pH升高棕黑色颗粒沉积明显增多，TRAM-34能够明显减少棕黑色颗粒沉积。钙含量测定结果基本与硝酸银染色结果一致。2碱性环境对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙离子浓度影响：细胞干预4天后，血管平滑肌细胞Fluo-3AM荧光强度和荧光显色结果显示，与正常对照组相比，高磷组平滑肌细胞荧光强度明显升高(P0.05)，且随着pH升高荧光强度逐渐升高(P0.05)；TRAM-34干预组平滑肌细胞荧光强度明显降低(P0.05)。3碱性环境对高磷诱导的血管平滑肌细胞KCa3.1、Runx2表达、ALP活性及大鼠胸主动脉环KCa3.1、Runx2表达的影响3.1碱性环境对高磷诱导的VSMCsKCa3.1、Runx2表达影响：细胞培养4天后，RT-PCR及WesternBlot结果均显示，高磷组平滑肌细胞KCa3.1、Runx2表达明显高于对照组(P0.05)，且随着pH升高表达逐渐升高(P0.05)。TRAM-34可抑制平滑肌细胞Runx2表达(P0.05)。ALP活性测定结果显示：细胞干预12天后，与正常对照组相比，高磷组细胞ALP活性显著增加(P0.05)，且随着pH升高ALP活性逐渐增加(P0.05)；与高磷pH8.0组相比，TRAM