鹅tlr3和tlr5基因的克隆及其功能分析-cloning and functional analysis of goose tlr3 and tl r5 genes.docxVIP

鹅TLR3和TLR5基因的克隆及其功能研究摘要传染病的频繁暴发严重制约养鹅业发展，主要原因是对其抗感染免疫机理知之甚少和防疫技术落后。系统研究Toll样受体（TLRs）在抗感染免疫过程中的作用不仅能为全面阐明鹅的免疫机理奠定基础，还为品种（品系）的优选及分子育种提供理论依据。本研究：利用聚合酶链式反应(PCR)和cDNA末端快速扩增技术(SmartRACE)分别获得鹅TLR3和TLR5的cDNA全长，预测其分子结构特征；设计荧光定量PCR引物，检测TLR3和TLR5在各组织器官的表达；构建真核表达载体与双荧光报告基因系统共转染HEK293细胞，通过特异性配体刺激检测TLRs激活对核因子-?B的活性影响；通过荧光定量PCR检测不同微生物（配体）刺激鹅外周血单核细胞后TLRs及其下游炎性因子mRNA表达量的变化。研究结果表明：（1）鹅TLR3cDNA序列全长2874bp，包括149bp的5′非编码区、34bp的3′非编码区和编码896个氨基酸的2691bp的开放阅读框，分子量为102.13kDa、PI为8.53。TLR3全长氨基酸序列包含1个信号肽、14个富含亮氨酸的重复序列(Leucine-richRepeat，LRR)、1个跨膜结构域和1个胞内TIR结构域(IL-R1homologousregion,TIR)。同源比对显示，与鸡TLR3具有较高的同源性(84.4%)。组织表达结果表明，TLR3在健康鹅的组织中分布广泛，其中在胰腺、脾脏和十二指肠中表达量最高。双荧光报告结果表明，鹅TLR3能在Polyi:c的刺激下引起NF-?B的活化。禽流感病毒（H5N1）刺激鹅外周血单核细胞（PBMC）后，能引起TLR3、IL-6和IFN-?的mRNA表达显著增加，而Polyi:c仅能引起TLR3和IFN-?的mRNA上调，且两种刺激物均无法上调IL-1?的mRNA表达量。相关分析结果发现TLR3的表达量与IFN-??mRNA表达量为正相关。（2）鹅TLR5cDNA序列全长2967bp，包括215bp的5′非编码区、384bp的3′非编码区和编码860个氨基酸的2583bp的开放阅读框，分子量为98.88kDa、PI为6.34。TLR5全长氨基酸序列包含1个信号肽、7个富含亮氨酸的重复序列、1个跨膜结构域和1个胞内TIR结构域。同源比对显示，与鸡TLR5的同源性最高（81.3%）。组织表达分析显示，TLR5在健康鹅的组织中具有较广的表达分布，其中在肾脏和脾脏组织中表达量最高。双荧光报告结果表明，鹅TLR5能在鞭毛蛋白（Flagellin）的刺激下引起NF-?B活化。沙门氏菌和鞭毛蛋白刺激PBMC后，均能引起TLR5、IL-1和IL-8的mRNA表达水平上调，而Flagellin刺激外周血单核细胞后不能引起IL-6mRNA的表达。相关分析结果发现TLR3的表达量与IL-8和IL-1?mRNA表达量为正相关。该研究成功克隆了鹅TLR3和TLR5基因全长，其分别以Polyi:c和Flagellin为特异性配体，经NF-?B信号通路活化炎性因子表达，从而在抗禽流感及沙门氏菌感染中发挥重要作用。关键词：鹅，Toll样受体，基因克隆，真核表达，功能MolecularCloningandFuctionStudiesongooseTLR3and5GeneAbstractFrequentoutbreakofinfectiousdiseasescauseshugeeconomiclossesingooseindustry,duetolittleisknownabouttheanti-infectionmechanismofimmunesystemandtheabsenceofabetterpreventiontechniquesinthisspecies.ToelucidatetheroleofTolllikereceptor(TLRs)intheprocessofanti-infectiveimmunityofgoosemaynotonlyimprovethepreventativeortreatmentalmethodstospecialdisease,butcollectedangeneticmaterialformolecularanti-diseasebreeding.Inpresentstudy,thereversetranscriptionpolymerizationchainreaction(RT-PCR)andPCRamplificationofcDNAends(SmartRACE)methodswereusedtoclonethefull-lengthcDNAofgooseTLR3andTLR5,andpredictedthemolecula