法舒地尔对表达于hek293细胞的kv7.4钾离子通道调节作用与机制的研究-study on the regulatory effect and mechanism of fasudil on kv 7.4 potassium channel expressed in hek 293 cells.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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法舒地尔对表达于hek293细胞的kv7.4钾离子通道调节作用与机制的研究-study on the regulatory effect and mechanism of fasudil on kv 7.4 potassium channel expressed in hek 293 cells

法舒地尔对表达于 HEK293 细胞的 Kv7.4 钾离子通道调节作用与机制的研究摘要目的：Kv7（Kv7.1-7.5）电压门控型钾通道家族由KCNQ基因编码，在调节神经元兴奋性（Kv7.2-Kv7.5）及心肌动作电位（Kv7.1）方面发挥着重要作用。普遍认为Kv7.2和Kv7.3通道组成的异四聚体构成了神经元M 电流的分子学基础，参与调解多种神经元的兴奋性。近来，研究发现Kv7.4、 Kv7.5通道在多种血管平滑肌细胞高表达，并参与调解血管的张力。而Kv7 的调节剂可影响平滑肌细胞的膜电位及血管张力。还有研究显示，在血管平滑肌细胞，Kv7.4/Kv7.5是以异四聚体的形式存在的。所以神经细胞（Kv7.2/Kv7.3）与血管平滑肌细胞（Kv7.4/Kv7.5）Kv7钾通道亚型表达的不同，为药物的选择性作用提供基础。非选择性 Kv7 钾离子通道调节剂在临床中可能产生一定的副作用，例如第一个作为 Kv7 开放剂上市的药物瑞替加滨（retigabine，RTG），它在治疗癫痫的同时，被发现有引发尿潴留的副作用，这是因为 Kv7 开放剂可激活膀胱平滑肌上表达的 Kv7 钾通道所致。大多数已报道的 Kv7 调节剂对 Kv7 家族的各亚型没有选择性，尤其是对 Kv7.2-Kv7.4。例如，瑞替加滨和氟吡汀（flupirtine）可以激活 Kv7.2~7.5，但对 Kv7.1 无显著作用。所以，Kv7 亚型选择性开放剂，或至少是对神经及血管上的 Kv7 钾通道具有亚型选择性的开放剂，对临床疾病的治疗具有重要意义。法舒地尔（fasudil），作为 RhoA/Rho 激酶（ROCK）抑制剂，在临床上用于脑血管痉挛性疾病及脑卒中后认知障碍性疾病的治疗，并且还被认为具有抗心绞痛的作用。在我们实验室前期的研究中发现法舒地尔可以选择性激活 Kv7.4/Kv7.5 通道，但对 Kv7.2/Kv7.3 通道无显著作用。本研究将探讨法舒地尔激活 Kv7.4 通道的分子机制问题。方法：利用电生理穿孔膜片钳技术，同源建模与分子对接技术及定向点突变技术探讨法舒地尔对 Kv7.4 钾离子通道的作用机制。结果：1 法舒地尔对表达于 HEK293 细胞的 Kv7 钾离子通道电流的选择性调节作用。法舒地尔选择性激活表达于 HEK293 细胞的 Kv7.4 和 Kv7.4/7.5 通道，但对 Kv7.1/KCNE1，Kv7.2 及 Kv7.2/7.3 无显著影响。2 利用同源建模及分子对接实验寻找法舒地尔与 Kv7.4 钾离子通道的作用位点。分子对接实验提示的 Ile308 可能为法舒地尔激活 Kv7.4 钾离子通道的关键位点。3 构建 Kv7.4(S6)钾离子通道突变体。利用定向点突变技术成功构建 Kv7.4 突变体，分别为：Kv7.4(I308V)、Kv7.4(L306I)、Kv7.4(L306I/I308V)、Kv7.4(G302T/A304T)。4 利用膜片钳技术观察 fasudil 对 Kv7.4(S6)钾离子通道突变体的作用。法舒地尔（30 μM）可以增大 Kv7.4(G302T/A304T)电流，增大程度与 Kv7.4 wildtype 没有区别。然而 Kv7.4(G302T/A304T)对 RTG (10 μM) 的敏感性明显降低了。而 Kv7.4(I308V)、Kv7.4(L306I)、Kv7.4(L306I/I308V) 对法舒地尔的敏感性显著下降了，而对瑞替加滨的反应与 Kv7.4 wildtype 没有区别。以上结果显示，S6 区的 Ile308 和 Leu306 为法舒地尔调节 Kv7.4 的关键位点。5 构建 Kv7.4(S5-Pore)钾离子通道突变体。利用定向点突变技术对 Kv7.4 的 S5-Pore 区的 6 个位点进行了突变，成功构建了 5 个 Kv7.4 突变体，分别为：Kv7.4(W242L), Kv7.4(V248C),Kv7.4(F251L), Kv7.4(D262G/A263E), Kv7.4(T278L)。结论：我们的结果显示 S6 区的 Ile308 及 Leu306 可能为法舒地尔选择性激活 Kv7.4 通道的关键位点。关键词：法舒地尔，Kv7.4 钾离子通道，定向点突变技术， HEK293细胞,分子机制，Selective effect of fasudil on Kv7.4 potassium channels expressed in HEK293 cells and the underlying mechanismABSTRACTObjective: Kv7 (Kv7.1–Kv7.5), a subfamily of voltage-gated K+ channels en