第六章酶00002.pptVIP

* * 第五节酶的分离、提纯及活性测定 一、酶的分离、提纯 由细胞内产生后分泌到细胞外发挥作用的酶，称为细胞外酶；这类酶大都是水解酶，这类酶一般含量较高，容易得到。 在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶。 第95页/共114页 一、酶的分离、提纯 (一) 酶的抽提 1. 破碎细胞膜 2. 抽提 (二) 纯化 常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法及吸附分离法等。 第96页/共114页 提纯过程中要注意 1．全部操作在低温0～4℃。 2．在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌。 3．在提纯溶剂中加一些保护剂如少量EDTA、少量β-巯基乙醇。 4．在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。 纯化过程检测指标： 总活力＝单位体积的酶活力(U/ml)×分离溶液总体积(ml) 总活力：损失情况 比活力：酶制剂纯度 第97页/共114页 酶的纯度用比活力表示，比活力即每毫克蛋白(或每毫克蛋白氮)所含的酶活力单位数。 比活力(纯度)=活力单位数/毫克蛋白(氮) 第98页/共114页 二、酶的活力测定 活力就是酶催化一定化学反应的能力。酶的活力大小，可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。酶催化的反应速度愈大，则酶的活力也愈大。所以测定酶的活力就是测定酶促反应的速度。 酶活力的高低以酶活力单位(U)表示。酶活力单位的含义是指酶在最适条件下，单位时间内，酶催化底物的减少量或产物的生成量。 第99页/共114页 酶单位的定义 1961年国际酶单位（IU）：最适反应条件（25度）下，每min内催化1μmol 底物成为产物所需要的酶量。 1972年Katal（简称Kat）单位：最适反应条件下，1s可使1mol底物转化成产物所需的酶量。 第100页/共114页 酶的转换数Kcat 酶的转换数(turnover number)是指单位时间，每一个催化中心所转换的底物分子数。通常指每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数(μmol)。 第101页/共114页 思考题？ 称取25mg蛋白酶配成25ml溶液，取2ml溶液测得含蛋白氮0.2mg，另取0.1ml溶液测酶活力，结果每小时可以水解酪蛋白产生1500ug酪氨酸，假定1个酶活力单位定义为每分钟产生1ug酪氨酸的酶量，请计算：(1)酶溶液的蛋白浓度及比活力(2)每克酶制剂的总蛋白含量及总活力。 （1）蛋白浓度=0.2×6.25mg/2ml=0.625mg/mL (2)总蛋白＝0.625mg/ml×1000=625mg 总活力＝625mg×400U/mg=2.5×105U 第102页/共114页 第六节重要的酶类 一、寡聚酶oligomeric enzyme 含有两个以上的亚基，分为含有相同亚基的寡聚酶和含有不同亚基的寡聚酶两大类。它们在机体代谢活动中具有重要作用，含有亚基的酶分子的聚合和解聚是代谢调节的重要方式之一。 第103页/共114页 二、同工酶 同工酶(isoenzyme)是指能催化相同的化学反应，但分子结构不同的一类酶，它不仅存在于同一机体的不同组织中，也存在于同一细胞的不同亚细胞结构中，它们在生理上、免疫上、理化性质上都存在很多差异。 同工酶的结构差异主要表现在：非活性中心部分不同或所含亚基组合不同。而酶活性有关部位结构相同。 第104页/共114页 乳酸脱氢酶同工酶（LDHs）为四聚体，在体内共有五种分子形式，即LDH1（H4），LDH2（H3M），LDH3（H2M2），LDH4（HM3）和LDH5（M4）。 第105页/共114页 第106页/共114页 心肌中以LDH1含量最多，LDH1对乳酸的亲和力较高，因此它的主要作用是催化乳酸转变为丙酮酸再进一步氧化分解，以供应心肌的能量。 在骨骼肌中含量最多的是LDH5，LDH5对丙酮酸的亲和力较高，因此它的主要作用是催化丙酮酸转变为乳酸，以促进糖无氧酵解的进行。 同工酶的生理意义： 第107页/共114页 乳酸脱氢酶同工酶的不同生理功能 心肌 骨骼肌 丙酮酸 葡萄糖 ATP+CO2+H2O 乳酸 LDH5 LDH1 乳酸利用 糖无氧酵解 第108页/共114页 同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断。 同工酶的临床意义： 心肌梗塞和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化 1 酶活性 心肌梗塞酶谱 正常酶谱 肝病酶谱 2 3 4 5 LDH 第109页/共114页 三、诱导酶 诱导酶(induced enzyme)是指当细胞中加入特定诱导物质而诱导产生的酶。它的含量在诱导物存在下显著增高，这种诱导物往往是该酶底物的类似物或底物本身。 第110页/共114页 四、调节酶 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 调节酶分子中有活性区和调节