实验三酶学实验.pptVIP

实验内容 实验十四 pH值对酶促反应速度的影响 实验十五 温度对酶促反应速度的影响 实验十六 底物浓度对酶促反应速度的影响 实验十七 抑制剂对酶促反应速度的影响 第1页/共22页 实验十四 pH值对酶促反应速度的影响 【实验目的】 1．掌握pH对酶促反应速度的影响。 2．了解测定酶活性的原理、学会操作。 第2页/共22页 【实验原理】 酶的本质是蛋白质，构象及电荷状态影响酶与底物的结合催化，因此酶活性会受溶液pH的影响。 底物或辅基的解离程度受溶液pH的影响。 酶的最适pH值 ：一定的pH范围内，酶才表现其催化活性，而且在某一pH值时，酶的催化活性达最大值。 AKP（碱性磷酸酶）活性测定：磷酸苯二钠法 第3页/共22页 铁氰化钾 第4页/共22页 【实验试剂】 （1）甘氨酸缓冲液：多种pH值 （2）酶液 （3）0.04mol/L基质液 （4） 0.3% 4-氨基安替比林 （5） 0.5%铁氰化钾溶液 第5页/共22页 【实验方法】 1.取小试管6支，编号，按下表操作： 管 号 1 2 3 4 5 6 甘氨酸缓冲液 pH 8.0 pH 9.0 pH 10.0 pH 11.0 pH 12.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 蒸馏水 1.0 0.04mol/L基质液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 置37℃水浴保温15min 酶 液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 第6页/共22页 2．立即混匀，置于37℃水浴中，保温15 min。 3．保温结束，各管分别加0.2mol/l NaOH 1 ml 终止反应。 4．各管分别加入1.0 ml 0.3% 4-氨基安替比林和2.0 ml 0.5% 铁氰化钾溶液，充分混匀，放置10 min，肉眼观察，比较各管颜色之深浅，用+ → ++++表示，观察哪一pH值下酶活性最强。 第7页/共22页 实验十五 温度对酶促反应速度的影响 【实验目的】 1．掌握温度对酶促反应速度的影响。 2．了解温度对酶促反应速度影响的测定方法。 第8页/共22页 【实验原理】 温度升高对酶促反应产生两种相反的效应： 反应速度随温度升高而加快， 酶蛋白变性失活的速度随温度升高迅速增加，从而使反应速度减慢。 酶的最适温度：酶促反应速度最快时的环境温度。 实验检测对象：碱性磷酸酶 第9页/共22页 （1）0.1mol/L pH10 碳酸缓冲液 （2）0.04mol/L 基质液 （3）酶液 （4） 0.3% 4-氨基安替比林 （5） 0.5%铁氰化钾溶液 【实验试剂】 第10页/共22页 【实验方法】 1. 取小试管5支，编号，按下表操作 加入酶液后，立即混匀，再置各温度下保温。 管 号 1 2 3 4 5 0.1mol/L pH10 碳酸缓冲液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.04mol/L 基质液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 预温5min 冰浴 室温 37℃ 75℃ 室温 血清或酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 - 保温15min 冰浴 室温 37℃ 75℃ 室温 第11页/共22页 2．保温结束后，立即加入1 ml 0.2 mol/l NaOH 终止反应。 3．各管再分别加入0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml及0.5%铁氰化钾溶液2.0 ml，充分混匀，室温下放置10 min， 4．肉眼观察，比较各管颜色之深浅，用+ → ++++表示，观察哪一温度下酶活性最强。 第12页/共22页 底物浓度对酶促反