实验5琥珀酸脱氢酶alt.pptVIP

了解琥珀酸脱氢酶的作用及 酶促反应中的竞争性抑制作用 实 验 目 的 第1页/共18页 竞争性抑制作用 抑制剂和底物的结构相似， 能和酶的底物分子竞争 与酶的活性中心相结合， 从而阻碍酶与底物结合 形成中间产物。 酶活性位点 第2页/共18页 抑制程度取决于抑制剂和底物对酶的相对亲和力 以及抑制剂和底物浓度比。 加大底物浓度可减弱甚至解除抑制作用。 第3页/共18页 实 验 原 理 延胡索酸 琥珀酸 还原型甲烯蓝 (白) 琥珀酸脱氢酶 甲烯蓝 (蓝) E + S ES E + P 琥珀酸 丙二酸 E + I EI 琥珀酸脱氢酶 FAD FADH2 第4页/共18页 操 作 步 骤 1、酶提取液的制备 　 1~1.3 g 兔肌肉(剪碎)＋海砂少许(1/3匙) 　 +2ml 磷酸盐缓冲液(1/15 mol/L)，研磨成糊状， 然后再加10ml 磷酸盐缓冲液(1/15 mol/L)混匀。 2、纱布过滤（双层） 3、取小试管五只，按书上P40表格加入各试剂。 最后加石蜡隔绝空气，37℃水浴保温。 每间隔10~15min观察一次结果，并记录。 第5页/共18页 实 验 结 果 编号 1 2 3 4 5 酶 有 有 有 有 无 底物 +++ +++ +++ + +++ 抑制剂 - +++ + +++ - 结果 第6页/共18页 第7页/共18页 注 意 事 项 注意区分肌肉与筋膜； 家兔肌肉必须充分剪碎碾磨，海砂不可加太多； 12 ml缓冲液要分次加入，不可一次性加入； 碾磨器械、纱布要及时清洗，纱布要洗干净晾干； 滴加试剂时，一定要看清试剂的名称和浓度； 滴加液体石蜡时沿着管壁倾斜加入，盖住液面即可； 观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝； 实验完成后试管要用皂粉清洗。 第8页/共18页 改良Mohum法测定鼠肝谷-丙转氨酶(GPT)活性 实 验 22 第9页/共18页 实 验 目 的 掌握GPT活性测定的基本原理 熟悉GPT活性测定的具体操作方法 了解血清GPT活性测定的临床意义 第10页/共18页 实 验 原 理 GPT 2,4-二硝基苯 丙氨酸 丙酮酸 ?-酮戊二酸 谷氨酸 在520nm波长测定其光密度，与已知浓度的丙酮酸溶液比较，即可计算谷-丙转氨酶的活性 丙酮酸二硝基苯（碱性溶液中呈棕色） 第11页/共18页 血清谷-丙转氨酶活性单位 在pH 7.4、37℃条件下， 每毫升肝匀浆与底物保温30min后， 每生成2.5 ?g的丙酮酸作为 1个谷-丙转氨酶的活性单位， 血清中GPT正常值为2-40 U/mL。 第12页/共18页 实 验 步 骤 标准管法测定酶活性： 1、取干燥试管4支，标号 测定管 对照管 标准管 空白管 2、依次加入试剂，混匀，37℃保温 3、呈色反应后，520nm比色测OD值 第13页/共18页 谷丙转氨酶活性单位/mL鼠肝匀浆 = ? U/ml 方法一：以空白管调0，测A测定、A标准、A对照 实 验 结 果 A测定 测定管中生成丙酮酸的质量 = ——— × m标准 A标准 A对照 对照管中生成丙酮酸的质量 = ——— × m标准 A标准 30min中生成丙酮酸的质量 = m测定 – m对照 A测定-A对照 = ————— × m标准 A标准 30min生成丙酮酸的质量 1 活性单位 = ———————————— · —— 2.5 ?g V测