生物化学课件药物研究生物化学基础15.ppt

第十五章 药物研究的生物化学基础 第一节 生物药物制造的生物化学基础 一、生物药物制备方法的特点 1、目的物存在于组成非常复杂的生物材料中 2、有些目的物在生物材料中含量极微，因此分离纯化步骤多，难于获得高收率 3、生物活性成分离开生物体后，易变性破坏，所以分离过程注意保护有效物质的生物活性 4、生物药物制造工艺几乎都在溶液中进行，各种理化因素和生物学因素对组分有综合性影响。 5、为了保护目的物的活性和结构完整性，生物药物工艺多采用“逐级分离”的方法 6、生物药物的均一性检测与化学上的纯度概念完全不同 生物药物分离制备方法的主要依据原理 1、根据不同组分分配率的差别进行分离 2、根据生物大分子的特性采用多种分离手段交互进行。 二、生物合成技术原理 生物合成是利用生物细胞的代谢反应(更多的是利用微生物转化反应)来合成化学方法难于合成的药物或药物中间体。 微生物转化反应是利用微生物的代谢才作用来进行某些化学反应，确切地说就是利用微生物代谢过程中某种酶对底物进行催化反应，以生成所需要的活性物质。 生物合成技术的另一领域是半合成技术。 氨苄青霉素合成 三、生物技术原理 生物技术(botechnology)又称生物工程(bioengineering)，是利用生物有机体(动物、植物和微生物)或其组成部分(包括器官、组织、细胞或细胞器等)发展新产品或新工艺的一种技术体系。 生物技术一般包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程。 三、生物技术原理 基因工程主要包括基因的分离、制备、体外剪切、重组、扩增、表达与产物的纯化等技术； 细胞工程则包括一切生物类型的基本单位一细胞(有时也包括器官或组织)的离体培养、繁殖、再生、融合以及细胞核、细胞质乃至染色体与细胞器(如线粒体、叶绿体等)的移植与改建等操作技术； 酶工程是指酶的工业化生产及其固定化技术以及由酶制剂构成的生物反应器和生物传感器等新技术、新装置的研究应用； 发酵工程也叫微生物工程，是在最适条件下，对单一菌种进行培养，是生物特定产品的一种生物工艺 三、生物技术原理 现代生物技术的核心内容主要包括重组DNA技术和单克隆抗体技术。 生物工程药物是指运用重组DNA技术和单克隆抗体技术生产的多肽、蛋白、激素和酶类药物以及疫苗、单抗和细胞生长因子类药物等 重组DNA技术又称基因工程，其操作过程主要包括：①目的基因的获取；②基因载体的选择与构建；③目的基因与载体的拼接；④重组DNA导人受体细胞；⑤筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞(转化子)；⑥工程菌(或细胞)的大量培养与目的蛋白的生产。 图15-2 由染色体DNA和cDNA构建重组DNA生产目的蛋白示意图 （一）基因载体 常用的基因载体(Vector)有质粒、λ噬菌体、M13噬菌体等。 逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA是将外源基因导人动物细胞的载体。 图15-3 pBR322质粒 （二）目的基因的来源 1、 直接从染色体DNA分离。 2、人工合成 3、从mRNA合成cDNA 4、基因文库 将生物体全部DNA提纯，用限制性内切酶随机切割成数以万计的片段，所有片段均重组在同一类载体上，得到许多重组体，又全部转化人宿主菌中保存起来，这就是基因文库。 用基因组(genome)的总DNA构建的为G－文库 用细胞全部mRNA经过反转录制备的cDNA后建库，则称为cDNA文库， （三）限制性内切酶的应用 核酸限制性内切酶(restriction endonuclease)能特异识别核酸分子某些碱基序列并加以切开 其切口类型有两种： 一种为平端(blunt end)切口、 另一种为粘端切口(sticky end)，即两链的切口错开2—4个核苷酸。 表15-1 常用的限制性内切酶 表15-1 常用的限制性内切酶 （四）重组体的构建 用同种限制性内切酶切割载体及目的基因后，无论产生的是平端切口或粘端切口，都可以用DNA连接酶把载体和目的基因连接起来，形成DNA重组体 粘端连接方式：如用HpaⅡ分别切割目的基因和质粒DNA，然后混合在一起，用连接酶作共价连接形成DNA重组体，这种方法称为粘端连接方式。 还有“尾接法”连接方式。在载体和目的基因上找不到共同的酶切位点时，可先把它们各自的粘端切口用单链核酸酶切平、在末端核苷酸转移酶作用下，催化脱氧单核苷酸加于DNA的3’—末端，使形成粘端结构。如一股DNA加上polyC，另一股DNA的3’曰末端加polyC，因C-C互补配对，两种DNA经连接酶处理，也可以形成共价结构的重组体。 图15-4 粘端连接方式 （五）重组体的转化 转化(transformation) ： 重组体如系大肠杆菌质粒，可在0-4℃用CaCl2处理大肠杆菌，以增大其细胞膜的通透性，再将CaCl2处理过的受体细菌与重组质粒温育，使质粒透人菌体，将重组DNA导