基因结构与表达分析的基本策略02.ppt

基因结构与表达分析的基本策略 一、双脱氧链末端终止法 （dideoxy chain termination） DNA自动化测序步骤 4种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTPs 第二节 核酸分子杂交 （Nucleic Acid Hybridization ） 二、Southern印迹杂交 (Southern blotting) 将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。 三、Northern印迹杂交 (Northern blotting) 指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。 用于mRNA定性和定量分析。 第四节 基因芯片和微阵列 DNA Chip and Microarray 引物的化学本质是什么？ 单链寡核苷酸DNA或RNA片段。 平台效应（plateau effect）： PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入平台期。 二、耐热DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 从嗜热水生菌(Thermus aquatics YT-1) 株中直接分离出来。 五、PCR改进技术 2. 实时荧光定量PCR（Real-time PCR） PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析 500bp 400bp 200bp 300bp 1000bp 600bp 700bp 800bp 900bp Markers PCR产物 基本原则： 1.引物与模板的序列要完全互补 2.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 3.引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(错配) 三、PCR引物设计原则 5′CACTGAACGTAGGCCT3′ 3′GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5′ 特异扩增 5′CACTGAACGTAGGCCT3′ 3′GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5′ 错误引发 1. 引物与模板的序列要紧密互补 2. 引物不能在模板的非目的位点引发  DNA聚合反应(错配) 引物之间应避免3′端互补 5′CACTGAACGTAGGCCT3′ 3′TCCGGATGCAAGTCAC5′ 3.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物自身不应形成发夹结构 1. RT-PCR(reverse transcription PCR) 以mRNA为模板逆转录合成cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应。 GAPDH 0d 2d 4d 6d 8d Northern blotting 检测基因表达 目的基因 基因芯片上的阵列是由有规则排列 的cDNA或寡核苷酸等样品所组成的 。 ● cDNA微阵列 ● 寡核苷酸微阵列 基因表达谱芯片主要技术流程 1.样品荧光标记 2.芯片制备 3.芯片杂交 4.芯片洗涤和扫描 5.扫描图像分析 C B A Cy5-标记 cDNA Cy3-标记 cDNA C B A C B A C B A C B A C B A C B A 样品1 样品2 Cy5/Cy3荧光标记 RNA提取 竞争性杂交显示 基因表达量差异 二种样品竞争性杂交示意图 基因表达谱芯片的原理 实验设计 基因芯片实验 图象分析 基因表达谱芯片研究应用思路 生物学问题提出， 表达基因分析， 样本分类与实验预测 某些基因表达异常或存在差异 生物学确证和解释分析 下一步实验设计 结果标准化 ● cDNA芯片可定量监测大量基因表达 水平，阐述基因功能，探索疾病原因 及机制、发现诊断及治疗靶基因等。 cDNA芯片在医学中的应用 ● Northern blot或RT-PCR验证。 ● 基因表达数据的生物信息学分析。 第五节 Western免疫印迹 原理：核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。 Western blotting程序： ● 蛋白质样品制备 ● SDS分离 ● 蛋白质转膜 ● 标记抗体与膜上蛋白质抗原杂交 ● 检测并分析标记物信号 Western免疫印迹信号检测原理 待测蛋白 膜 一抗 二抗-HRP 高酸 氧化产物 氧化型HRP + luminol + 增强剂 光子 Luminol化学发光原理 过氧化物酶 另一种信号显示方法是在洗去一抗后，加入碱性磷酸酶标记的二抗，