干细胞通路蛋白beta-catenin及gli1与儿童急性淋巴细胞白血病复发的相关性研究-correlation between beta - catenin and gli - 1 of stem cell pathway proteins and recurrence of childhood acute lymphoblastic leukemia.docxVIP

中文摘要【背景与目的】普遍认为，白血病治复发的根本原因主要是治疗过程中休眠逃逸且能 自我增殖克隆的白血病干细胞的存在。而在白血病干细胞自我更新、增殖克隆及生存中， 干细胞自我更新通路扮演着重要的角色。干细胞自我更新通路的异常激活可导致白血病细 胞分化成熟受阻，造成恶性克隆的异常蓄积，进而导致白血病复发。wnt/beta-catenin 通路及 hedgehog/gli1 通路是两条经典的干细胞自我更新通路。研 究发现，这两条通路的异常激活与多种血液系统恶性克隆的持续存在相关，并且影响临床 预后，但具体的致病机制仍不清楚。现有关于血液系统恶性疾病与干细胞自我更新通路的 研究多侧重于单一通路的研究，主要集中在髓性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等研究中， 目前缺乏干细胞自我更新通路与儿童急性淋巴细胞白血病的相关性及通路间是否可能存 在交联致病作用的研究。本研究中，我们将这两条干细胞自我更新通路的核心因子 beta-catenin( 来自 wnt/beta-catenin 信号通路)及 gli1(来自 hedgehog/gli 信号通路)作为检测靶目标，通 过检测儿童急性淋巴细胞白血病患儿治疗处于不同状态时（复发或缓解）骨髓单个核细胞 中 beta-catenin 及 GLI1 的表达差异，探索在儿童急性淋巴细胞白血病中的主导干细胞自 我更新通路，初步探索白血病复发的分子机制，为下一步研究奠定基础。【材料与方法】 对象：选取在汕头大学医学院第二附属医院初次就诊且在我院进行规则治疗并定期随 访4 年（2009-2014）的急性淋巴细胞白血病患儿 12 例，并根据患儿治疗过程中有无出现 复发事件分为两组，其中复发组 5 例（T-ALL 1 例，B-ALL 4 例），出现复发事件后随访终止，视为追踪结局状态。未复发组 7 例（其中 T-ALL 3 例，B-ALL4 例），随访大于 4 年后 随访终止，持续缓解状态视为结局状态。治疗期间在取得患儿家属及监护人知情同意和伦 理审核通过后予骨髓穿刺术并留取患儿各时间点的骨髓标本（骨髓穿刺术时间均按中国白 血病诊疗临床路径规定）。在本研究中，每个组各取两个时间点的骨髓标本进行预实验检 测:复发组:第一次完全缓解(1st CR)、追踪结局状态（复发时）标本；未复发组：第一次完 全缓解（1st CR）、追踪结局状态（持续完全缓解）标本。由于正常儿童骨髓标本获取的困III难及伦理争议，本实验未能找到正常儿童骨髓作为阴性对照,仅依据不同时间的变化形成自身对照。方法：（1）采用 WESTERN BLOT 法方检测两组患儿第一次 CR 状态及结局状态骨髓单个 核细胞 beta-catenin 及 gli1 的表达情况，T-TEST 方法分析各组各时间点的表达差异。（2） 流式细胞术检测同一样本的细胞表面分化抗原 CD34 及微小残留白血病（MRD），采用 Spearman 相关分析分析 beta-catenin 及 gli1 的表达与微小残留白血病（MRD）及 CD34 的 相关性。（3）我们将 beta-catenin、GLI1、CD34、MRD 检测结果与 ALL 患儿临床资料结合 起来，采用 spearman 系数分析复发事件及无复发缓解时间的相关因子。【结果】(1) 本研究中， 12 例 急 性 淋 巴 细 胞 白 血 病 患 儿 骨 髓 单 个 核 细 胞 中 均 可 检 测 到 Beta-catenin 和 gli1 的共表达。复发时骨髓单个核细胞 beta-catenin 及 gli1 的 表达较完全缓解状态明显升高,而第一次 CR 状态与持续 CR 状态的 beta-catenin 及 gli1 的表达无明显差异。并且，随着两组结局事件的不同（复发或持续 CR）， beta-catenin 及 gli1 在两个检测状态的表达变化也存在明显差异。(2) 本研究中，Beta-catenin 及 gli1 的表达与急性淋巴细胞白血病患儿骨髓微小残留 白血病（MRD）及复发事件存在高度正相关。 在两个检测状态间 beta-catenin、gli1 的变化趋势也与 MRD 的变化趋势呈现高度相关性，说明，beta-catenin 及 gli1 的 表达与白血病恶性克隆及复发高度相关。(3) 本研究中，Beta-catenin 和 gli1 在 12 例儿童急性淋巴细胞白血病患儿骨髓单个核 细胞的表达始终呈现高度正相关关联。这表明，beta-catenin 和 gli1 协同参与白 血病恶性克隆的增生，wnt/beta-catenin 信号通路及 hedgehog/gli1 信号通路间可 能存在交联。(4) 本研究中，CD34 的表达与复发事件呈现负相关关联，而与无复发缓解时间呈现正相 关关联。复发时骨髓单个