《食品酶学》第2篇 章 酶的分离纯化(精制).ppt

盐析沉淀法 盐析沉淀法简称盐析法，是指盐浓度达到一定程度后，蛋白质和酶的溶解度随盐浓度的升高而减少，使蛋白质和酶析出的现象。 该方法在酶的分离纯化中应用最早且至今仍在广泛使用的方法，主要用于蛋白类酶的分离纯化。 盐影响蛋白质在水中的溶解度，一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出。 在某一浓度的盐浓度中，不同蛋白质的溶解度各不相同，由此可达到彼此分离的目的。 盐之所以会改变蛋白质的溶解度，是由于盐在溶液中离解正离子和负离子。 由于反离子作用，使蛋白质费分子表面的电荷改变，同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改变。 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。 硫酸铵在水中的溶解度大而温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，且铵离子的存在往往会干扰蛋白质的测定，有时也用其他中性盐来进行盐析。 不同的酶有不同的结构，故盐析时所需的盐浓度各不相同。 另外酶的来源、酶的浓度、杂质的成分等对盐析时所需盐浓度有所影响。 盐析时，温度一般维持在定温左右，溶液的pH值应调整到目的蛋白质的等电点附近。 盐析时得到的酶沉淀，含有大量盐分，一般可以采用透析、超滤或层析等方法进行配盐。 等电点沉淀法 定义：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，对酶、蛋白质、氨基酸等两性电解质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀。 原理：在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力排除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。 但在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在，使酶等大分子物质仍有一定的溶解性，而使沉淀不完全，故等电点法往往与其他方法一起使用。 如：等电点沉淀法经常与盐析沉淀法以及溶剂沉淀法和复合沉淀法等一起使用。单独使用主要用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。 有机溶剂沉淀法 定义：利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法。 机理：有机溶剂的存在使溶液的介电常数降低，进而使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集。同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用使溶质分子表面的水膜被破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。 优点：与盐析法相比，析出的沉淀更易于离心或过滤分离，不含无机盐，分辨率较高。 缺点：但此法易引起酶的而变性失活，必须在低温条件下操作，而且沉淀析出后要尽快分离，以尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。 有机溶剂种类：乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。 有机溶剂的用量：有机溶剂的用量一般为酶液体积的2倍，有机溶液的体积分数约70%，不同酶和使用不同的有机溶剂时，使用浓度也不同。 复合沉淀法 定义：在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，分离出沉淀后，再用适当的方法使酶从复合物中析出，这种分离纯化的方法称为复合沉淀法。 常用的复合沉淀剂：单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。 选择性变性沉淀法 定义：选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白变性沉淀而不影响所需的酶，这种分离方法称为选择性变性沉淀法。 例如：对于热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而除去。另外，还可根据酶的特性，通过改变pH值或加入某些金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。 本节复习题 1.沉淀分离的定义和种类 2.盐析沉淀法的定义及应用和所用中性盐 3.盐析沉淀法分离的机理 4.等电点沉淀法的定义、原理和应用 5.有机溶剂沉淀法的定义、机理、优缺点、有机溶剂种类和用量 6.复合沉淀法的定义和常用复合沉淀剂 7.选择性变性沉淀法的定义及其应用 2.6层析分离 定义：层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使个组分以不同程度分布在两相中（其中一个相是固定的相称为固定相；另一个是流动的称为流动相），当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。 种类：吸附层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析。 吸附层析 定义：是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。是各种层析技术中应用最早且至今仍广泛使用的技术。 吸附：任何两相之间都可以形成一个界面，其中一个相的物质或溶质在两相界面上的密集现象称为吸附。 吸附剂：凡是能够将其他物质聚集到自己表面上的物质称为吸附剂。 被吸附物：能聚集于吸附剂表面的物质被称为被吸附物。 吸附剂种类：硅藻土、氧化铝、磷酸铝、羟基磷灰石和活性炭等。