红细胞免疫实验所选择一些测定指标.ppt

一、红细胞免疫概述： 二、Ｅ花环率（红细胞的免疫吸附）测定 三、唾液酸（ＳＡ）测定 四、封闭度的测定 五、流动性的测定 六、带3蛋白(band3)测定 红细胞免疫概述 近年来随着免疫学研究的逐步深入，人们已认识到红细胞（ＲＢＣ）不仅具有呼吸功能，而且像白细胞一样具有免疫功能。现发现红细胞具有识别、粘附、浓缩、杀伤抗原，清除免疫复合物(IC)的能力，参与机体的免疫调控，并有完整的自我调控系统。而且在人体的血液系统中，红细胞比白细胞数量多、代谢快，所以在抗肿瘤免疫反应中，红细胞应该发挥着重要调控作用，形成抗肿瘤免疫调控网络，开辟综合治疗肿瘤的一条新的思路和机制。 而对于红细胞免疫检测的方法，从1982年开始，基本建立了红细胞C3b受体和免疫复合物花环实验、单克隆抗体Coombs试验、红细胞SPA花环试验、酵母多糖血凝法、调节因子活性测定及肿瘤血凝法等10余种经典的免疫监测方法。随着对红细胞免疫的进一步深入研究，国内外又建立了测定红细胞C3b受体活体发光法，红细胞膜促白细胞吞噬作用的化学发光法免疫金银染色法，肿瘤细胞血凝法和酶法及直向肿瘤红细胞花环试验等10余种新的方法。这些方法的建立大大促进了红细胞免疫的基础理论和临床研究的进展。 Ｅ花环率（红细胞的免疫吸附） 红细胞膜表面上有糖蛋白受体，因此RBC通过受体可免疫粘附各种肿瘤细胞，而且通过过氧化物酶等作用，对癌细胞具有效应细胞作用，可阻止癌细胞血行转移，并与肿瘤病人的病情疗效，转移密切相关.而红细胞之所以能够黏附各种肿瘤细胞，主要是因为红细胞膜上有一些受体。如血循环中95%的C3b受体(CR)存在于经红细胞表面，因此红细胞CR是红细胞免疫粘附作用的关键部位，并在运送和清除IC方面起着重要作用。判断红细胞免疫功能的主要指标为CR和IC. 实验所需要的药品及仪器: 新鲜豚鼠或者人的新鲜血液; 0.25%戊二醛,瑞士染色剂,载玻片,盖玻片, 高倍显微镜 测定方法：昆明种小鼠接种瘤株，接种次日开始给药，连续7天，于停药第二天处死，取血，离心、洗涤制成红细胞悬液（1×108/ml）待用。 小鼠肝癌H22细胞接种于昆明种小鼠腹腔连续传代，实验时无菌抽取7天龄腹腔肿瘤细胞以Hankis液洗涤2遍，制成肿瘤细胞悬液（1×106/ml）。取此悬液0.1ml加等体积豚鼠（或人）新鲜血液，37°C水浴1小时，洗涤离心2次，弃上清液，成为血清致敏癌细胞，加0.05ml红细胞悬液,37°C水浴30分钟，加0.25%戊二醛固定、涂片、瑞氏染色. 肿瘤细胞兰色，红细胞红色，一个肿瘤细胞结合3个以上红细胞为肿瘤红细胞花环。 计算花环率。 需要注意的问题： 1 小鼠取血前最好禁食不禁水12h，才能取出较多的血。 2 人的新鲜血液一定要保持新鲜，才能成为血清致敏癌细胞。 3 瑞士染色剂最好在一个月以前就配置好，最好是保存三个月以上。 4 查Ｅ花环时一定要查准。 唾液酸（ＳＡ） 唾液酸（SA）是广泛存在于各种生物组织中的，构成细胞表面复合糖质的组成部分,是细胞膜上糖链末端的残基，是膜上负电荷的来源，对保持细胞的正常生理活动和功能十分重要，唾液酸增多影响细胞膜表面电荷特性，膜的物质转运过程。有关资料表明，SA具有明显的抗识别作用，许多癌化后的细胞，其表面富含唾液酸粘蛋白。 有研究表明，唾液酸转移酶与肿瘤转移密切相关。细胞膜表面唾液酸含量与肿瘤的恶性程度有关，发现随着肿瘤的生长，红细胞膜上的唾液酸含量增加。红细胞中的唾液酸主要存在红细胞膜上，唾液酸含量增多，可影响红细胞膜（RBC）表面电荷磁性，膜的转运物质过程、抗原决定簇的暴露、免疫应答细胞活性、膜表面受体功能等因素。 一些抗癌药物可抑制唾液酸转移酶活性，减少细胞表面唾液酸含量，显著降低肺癌转移的结节散，使小鼠的生存时间延长。在大鼠试验中，它们能抑制大肠癌的肝转移。其作用机制不是直接作用于癌细胞，而是通过抑制唾液酸转移酶，诱导细胞表面糖链结构改变，从而影响癌细胞与正常细胞的相互作用。综上所述，抑制唾液酸转移酶，降低癌细胞表面唾液酸含量，是某些抗转移药物的主要机制之一。 实验所需要的药品及仪器: 蛋白酶水解抑制剂对甲苯磺酰胺（PMSF）（Sigma公司）；考马斯亮蓝CBBG250（南京建成生物工程研究所）；蛋白标准品（南京建成生物工程研究所）；唾液酸标准品（浓度（南京建成生物工程研究所）；5-甲基苯二酚（南京建成生物工程研究所）。 仪器 :离心机（北京医用离心机厂）；低温高速离心机（BECKMAN AvantiTM68 centrifuge）；电热恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）；751分光光度计（上海第三仪器厂） 　 　测定方法： 取全血离心,3000转/分，10分钟，1:3生理盐水洗涤2次，1:1悬浮在生理盐水中制成红细胞悬液;加入5p 8.4磷