许氏平鲉性别相关基因sox3 sox9和dmrt1的分析-analysis of sex-related genes sox 3 sox 9 and dmr t1 in silurus meridionalis from xu shi.docx

独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证书使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学 术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入 CNKI《中国知识资源总库》，授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。（保 密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年月日签字日期：年月日许氏平鲉性别相关基因 Sox3、Sox9 和 Dmrt1 的研究摘要许氏平鲉 (Sebastes schlegeli) 具有抗病力强，个体大，生长速度快，卵胎生 等优势，现已成为我国北方重要的养殖鱼类。然而，对于其性别决定和性腺发育机 制了解的还很少。对许氏平鲉性别相关基因的研究，将有助于今后繁殖和育种工作 的开展。另外，以卵胎生机制的许氏平鲉为研究对象，也将有利于我们更好地理解 鱼类性别决定机制。本研究从性腺分化相关的几个关键基因入手，通过同源克隆和 RACE 技术获得了许氏平鲉 Sox3、Sox9 及 Dmrt1 基因全长 cDNA，研究了这 3 个 基因的结构、启动子序列及在成体不同组织和发育时期的时空表达情况。并从表观 遗传学水平研究了许氏平鲉 Sox3 基因启动子区 CpG 岛甲基化水平与基因表达差异 的关系。同时，对许氏平鲉 GnRH-I 进行了原核表达，通过体内注射研究了这 3 个 基因在未成熟许氏平鲉性腺中的表达变化情况。另外，本文还研究了许氏平鲉在仔 鱼发育时期和成体不同组织中内参基因的表达变化，筛选出了合适的内参体系。具 体结果总结如下： (1)本研究通过geNorm、NormFinder和Bestkeeper三种不同的软件对许氏平鲉8个候 选内参基因(18S rRNA、ACTB、GAPDH、TUBA、RPL17、EF1A、HPRT和B2M)的表达稳定性进行了分析，并在不同组织和仔鱼发育时期筛选出了最优的内参基因：RPL17和EF1A。(2)许氏平鲉Sox3基因cDNA全长1386 bp，包括906 bp的ORF（301 aa），197 bp的 5’UTR和283 bp的3’UTR。编码蛋白含有保守的HMG结构域。多个生物信息学软件 分析许氏平鲉Sox3基因启动子区存在多个转录因子结合位点，包括转录激活蛋白 AP-1、GATA-3、八聚体结合蛋白/cgi-bin/pub/databases/transfac/getTF.cgi?AC=T00641amp;T00642amp;T00643amp;T00959amp;T01031amp;T01157amp;T01466amp;T00644Oct-1、叉头框蛋白FOXD3、同源盒基因PBX1、 肝细胞核因子HNF4、HNF3β、CCAAT/增强子结合蛋白C/EBP、GATA-1、GATA-3、 GATA、核因子NF-1、特化蛋白Sp1、上游刺激因子USF及性别相关蛋白SRY、Sox5、 Sox9等结合位点。另外，从分子遗传学水平上分析了许氏平鲉Sox3基因启动子区 CpG岛甲基化组织差异模式，可知该基因CpG岛甲基化水平跟组织差异表达量不相 关。实时定量PCR显示，许氏平鲉Sox3基因在仔鱼发育时期（出生后1、5、10、15、 25、35天）都有不同程度的表达，并呈现出逐渐降低的趋势；在成体性腺中表现出I性别两相性差异，即在卵巢中的表达强于精巢。组织切片原位杂交显示该基因的mRNA主要定位于卵巢的卵母细胞和滤泡细胞，在精巢的生殖细胞中也有微量表达。 (3)许氏平鲉Sox9基因cDNA全长2039 bp，包括1461bp的ORF，336 bp的5’UTR 和 242 bp的3’UTR。其编码产物（486 aa）含有保守的HMG结构域。生物信息学软件分析Sox9基因启动子区存在很多与Sox3基因启动子共同的转录因子结合位点，如 AP-1、GATA-3、/cgi-bin/pub/databases/transfac/getTF.cgi?AC=T00641amp;T00642amp;T00643amp;T00959amp;T01031amp;T01157amp;T01