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基因芯片的疾病诊断 09生科 组员：曹小婷 蔡雅芬 黄小红 苏伟娇 陈玉红 郑碧女 一、分子诊断技术的概述 分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，称为分子诊断。 分子诊断是当代医学发展的重要前沿领域之一，常规技术包括： 　　（1）聚合酶链式反应（PCR）； 　　（2）DNA测序（DNA sequencing）； 　　（3）荧光原位杂交技术（FISH）； 　　（4）DNA印迹技术（ DNA blotting ）； 　　（5）单核苷酸多态性（SNP） 　　（6）连接酶链反应（LCR）； 　　（7）基因芯片技术（gene chip）。 基因芯片实验操作流程包括样本DNA或RNA制备、标记、杂交及洗涤等步骤 3 基因芯片的主要类型 从点阵的制备方法来分主要有两类：原位合成型与“点膜”型。 “点膜”型 合成工作用传统的DNA固相合成仪完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷，以便能够牢固地结合寡核苷酸分子。该方法是目前大多数中小型公司所采用的方法。 优点：设备廉价，技术简便，研制周期短，灵活性高 缺点：点阵密度低 基因芯片技术的主要特点: 技术操作简单 自动化程高 序列数量大 检测效率高 应用范围广 成本相对低 目前基因芯片的应用主要体现在以下几个方面： 基因表达分析 基因型、基因突变、多态型等分析 疾病的诊断与治疗以及应用于药物研究等。 基因诊断是基因芯片最主要的应用之一。从患病动物基因组中分离出DNA,与基因芯片杂交得出病变图谱;与正常图谱比较分析,获得病变DNA信息,知道DNA突变部位和序列,从而做出正确诊断。可以检测肿瘤病、遗传病、传染病等。 丙型肝炎的危害： 在全球，丙肝是死亡率第十的传染性疾病;在中国，丙肝是死亡率第五的传染性疾病。HCV形成严重的肝脏损伤通常是在20-30年之后, 疾病的影响即将到来。这些患者将可能发展为肝硬化或肝癌，需要进行肝移植。此外，研究还表明，丙型肝炎中，患糖尿病的人数增加。 原理 设计 HCV 基因型特异探针，将其固定在玻璃片上制成微阵列芯片。阳性组血清 60 份，阴性组血清 15 份，乙型肝炎血清 5 份（抗 HCV 阴性）。经核酸提取，多聚酶链式反应（PCR）扩增，与芯片上的探针杂交，最后分析结果并与测序分型结果比较。 具体操作步骤 1、 HCV 的基因芯片分型 ①设计基因型特异探针：针对 HCV 5‘NCR 区设计不同基因型和亚型的探针。涵盖 4 个基因型，6 个亚型。阳性参照Ⅰ为HCV 通用探针，阳性参照Ⅱ为一段与 HCV 无同源性的寡核苷酸片段。阴性参照Ⅰ和Ⅱ为不含任何寡核苷酸片段的空白液。 ②点制芯片：探针溶液经稀释后，用点样仪点在醛基修饰过的玻璃片上，形成探针微阵列。 ③设计通用引物：在丙型肝炎病毒基因组5‘NCR 区设计两对 PCR 引物。 外引物： 正义：5‘-CTGTGAGGAACTTCTGTCTTC-3’，反义：5‘-CATGATCGGTCTACGAG-3’； 内引物： 正义：5‘-GCCATGGCGTTAGTACGAG-3’， 反义：5-CTCGCAAGCACCCTATCAGG-3。内引物用地高辛标记。 ④HCV-RNA 检测：在离心管中加入 50 μl 血清，使用 Trizol 裂解法提取核酸，经异丙醇和乙醇洗涤，得到含 HCV-RNA 的沉淀。经逆转录，得到 HCV-cDNA 产物。套式 PCR 扩增，参数：94℃ 5 分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 30 秒，30 个循环；72℃ 5 分钟。 ⑤芯片杂交分型：将 PCR 产物同杂交液混合，42℃下与芯片上的探针孵育 30 分钟。然后将芯片置于 SSC 和 SDS 溶液中洗脱。滴加封阻剂和地高辛抗体，室温放置 30 分钟，漂洗。取硝纤维膜，浸润显色液后小心贴于芯片上，室温避光放置 20 分钟。将纤维膜漂洗晾干后保存，此时即可肉眼判读结果。 2、 HCV 的核苷酸测序分型 所有阳性样品同等条件 PCR 扩增两组，一组产物芯片杂交分型，另一组送到相关检测机构测定核苷酸序列，根据测序结果鉴别基因型。统计学处理 两组分型结果采用四格表 x2检验。 3、电泳 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测，阳性血清60 例都有电泳条带，大小为 246 bp，与目的片段长度符合。阴性血清 15 例，HBV 血清 5 例，电泳结果全部为阴性（图 1）。 4、芯片杂交 杂交阳性组