端粒酶htert基因反义rna表达载体的构建及其对肝癌细胞smmc-7721的感化.pdfVIP

摘 要 端粒是真核细胞线性染色体末端特殊的DNA-蛋白质结构 具有维持染色体的结 构稳定和生物功能的作用 随着细胞分裂端粒每次缩短30 200 bp 当端粒缩短到某 . 临界长度时 细胞则发生衰老或凋亡 而许多肿瘤细胞由于某种机制的作用 激活了 端粒酶从而使端粒维持在一定长度 使癌细胞能够持续繁殖 端粒酶是一种核糖蛋白 酶 端粒酶催化亚基具有逆转录酶活性 能以自身RNA 为模板 向染色体末端添加 端粒序列 弥补端粒的丢失阻止端粒缩短 据统计 大部分恶化肿瘤中端粒酶检测为阳性, 由于端粒酶活性和肿瘤细胞的生 存与转化间存在如此高的相关性 人们认为两者之间必然有某种联系 端粒酶激活可 能是细胞癌变或永生化的一个必然通路 因此抑制端粒酶活性可作为肿瘤基因治疗的 一个理想的新靶点 本文以分子克隆技术成功构建人端粒逆转录酶(hTERT)基因反义RNA 表达载体 研究其对肝癌细胞SMMC-7721 生长的影响 采用聚合酶链反应 PCR 扩增hTERT 基因片段 经测序证实后 反向插入到表达载体 pcDNA3.1/myc-His 中 成功构建 hTERT 基因反义表达载体 pcDNA3.1-hTERT(as) 经脂质体介导转染人肝癌细胞株 SMMC-7721,通过新霉素类似物(G418)筛选获得表达端粒酶 hTERT 基因反义 RNA 的稳定细胞株 采用噻唑蓝 MTT 法 端粒重复序列扩增-酶连免疫吸附检测法 TRAP-ELISA 流式细胞术和荧光定量PCR 仪分别观察细胞的增殖 端粒酶的活 性和细胞凋亡及细胞hTERT 基因mRNA 的水平 结果发现 1. 通过细胞生长曲线的绘制和MTT 法研究端粒酶hTERT 基因反义RNA 对肝 癌细胞 SMMC-7721 生长的影响 结果表明 与对照组细胞相比 hTERT 基因反义RNA 能明显抑制肝癌细胞生长 2. 通过TRAP-ELISA 法研究端粒酶hTERT 基因反义RNA 对肝癌细胞端粒酶 活性的影响 hTERT 反义RNA 转入肝癌细胞SMMC-7721 后 与对照组相 比 细胞端粒酶活性明显降低 3. 通过流式细胞仪研究端粒酶 hTERT 基因反义 RNA 对肝癌细胞的凋亡和细 I 胞周期的影响 转染hTERT 反义RNA 的SMMC- 7721 肝癌细胞在培养一段 时间后出现DNA 亚二倍体凋亡峰 凋亡率为13.77%,明显高于SMMC-7721 肝癌细胞的 3.29%和转染空载体 pcDNA3.1 的 SMMC-7721 肝癌细胞的 3.37% 凋亡率显著提高 与对照组相比 转染hTERT 反义RNA 的SMMC- 7721 肝癌细胞的细胞周期发生明显变化 其S 期细胞数量明显增加 G /G 0 1 期细胞数量明显减少 4. 通过荧光定量 PCR 仪研究端粒酶 hTERT 基因反义 RNA 对肝癌细胞的 hTERT mRNA 水平的影响 与对照组相比 转染细胞的hTERT mRNA 的水 平无变化 本研究表明hTERT 基因反义RNA 可有效抑制肝癌细胞生长和诱导细胞凋亡 为 反义RNA 治疗肝癌提供了实验基础 为肝癌的基因治疗提供了一种新的方法 关键词 端粒 端粒酶 反义RNA 肝癌细胞 II Abstract Telomeres