毛细管电泳化学发光均相免疫阐明和药物阐明研究.pdf

摘 要 毛细管电泳化学发光均相免疫分析和 药物分析研究 分析化学专业博士研究生 张迎雪 指导教师章竹君教授 (摘 要) 均相免疫分析(HonlogenousIm舢mo笛say)是在免疫反应后，不需将标记的游离抗原(或 抗体)与标记的免疫复合物分离，直接在溶液中对抗原或抗体进行测定。其特点是操作简便， 省时。将具有高效分离性能的毛细管电泳(CapiIlaryElec仃opho陀sis，CE)技术用于免疫分析， 可有效消除干扰，结合高灵敏度的化学发光检测方法，可大大提高测定的灵敏度。这样，一 直困扰着均相免疫分析的选择性和灵敏度问题在毛细管电泳技术和化学发光检测联用后，都 得到了较好的解决，使之成为一种取样少，灵敏度高，重现性好，容易实现自动化分析的均 相免疫分析方法，具有较大的发展潜力。 在药物分析方面，毛细管电泳以其优良的分离性能，加之与各种检测方法的联用技术迅 速发展起来，在体内药物代谢、药代动力学研究和药物质量控制，基于药物靶点的研究，特 别在处理纳升级样品和单细胞分析等方面正在成为一种重要的工具。对了解药物在体内的吸 收、分布、代谢、转化，减少药物的毒副作用，改造药物分子结构以及提高疗效都具有十分重 要的意义。 化学发光分析具有很高的灵敏度，非常适合作为高效液相色谱和毛细管电泳分析的检测 器，主要缺点是由丁二存在柱后反应，通常检测池的死体积也比较大，会造成峰变宽，从而影 响分离度。这也是至今为止仍然没有开发出实用T．毛细管电泳分析的商品化的化学发光检测 器的主要原因之一。在本研究中，设计了一种很简单的微璎反应器，在反应器中化学发光反 应一经进行就能立刻被窗口检测到，且无任何死体积和稀释效应存在。应用这一新的设计组 合而成的毛细管电泳—化学发光分析的仪器，成功地实现了纳升级人血样本中促黄体生成激 素、促卵泡生成素及乙肝表面抗原和表面抗体的测定，拓宽了均相免疫分析领域。本论文还 两南大学博+学传论文 发展了毛细管电泳的化学发光检测新技术，建立了测定人血中左旋多巴及其代谢物，尿样中 的氟喹诺酮类药物，猪尿中的沙丁胺醇、克伦特罗和己烯雌酚及人血清中氯丙嗪和异丙嗪的 毛细管电泳化学发光分析新方法。 1．毛细管电泳化学发光免疫分析 本论文的第一部分主要基于辣根过氧化物酶对鲁米诺一过氧化氢发光底物溶液的催化 作用，利用不同的免疫分析模式，和不同的发光增敏剂，对病毒和激素类物质进行了定量的 测定。主要有三个内容：一是同时应用竞争和非竞争免疫分析法测定了人体血清中乙肝表面 抗原和表面抗体；二是m1F竞争免疫分析法测定了人体血清中的促黄体生成激素；三是用竞 争性免疫分析法测定了促卵泡生成素。 (1)毛细管电泳化学发光免疫分析人血清中的乙肝表面抗原和表面抗体 本文提出一个毛细管电泳(CE)化学发光(CL)检测的高灵敏的均相免疫方法测定了 人体血清中的乙肝表面抗原和表面抗体。以辣根过氧化物酶(HRP)作为酶标物标记的乙肝 表面抗原僻BAg幸)作为研究对象详细优化了化学发光条件和电泳条件，源于HRP对鲁米诺 过氧化氢发光反应的催化作用。对碘苯酚作为此发光反应的增敏剂。发光检测池设计的比较 独特，不存在任何死体积和稀释效应。该方法分别采用竞争和非竞争模式测定了人体血清中 的乙肝表面抗原和表面抗体。在最优条件下，乙肝表面抗原和表面抗体的线性范围分别是l～ 400 pmol／I。伙=o．9988)和2～200m砌／ⅡlL似=o．9981)，检出限分别是0．4pmol几和1 InIU／mL。以80舯【loI／LHBsAg宰(萨7)作为研究对象，峰面积的相对标准偏差是4．2％，偏差是 一O．03％至+O．05％。本研究中，利用硼酸做为电泳缓冲液，6分钟内，游离的HBsAg·和结 合的HBsA矿免疫结合物得到了很好的分离。我们将实验结果和传统的酶联免疫吸附法做了 对比，进一步阐述了CECL免疫法在临床诊断上的可行性。 (2)毛细管电泳化学发光非竞争免疫法测定人体血清中的促黄体生成激素 基于毛细管电泳化学发光检测的非竞争免疫法测定了人体血清中的促黄体生成激素 (LH)，对于血清样分析的发光条件和分离条件都进行了详细的研究。在本研究中，辣根过 氧化物酶(Hl冲)标记的单克隆抗体能增敏鲁米诺一过氧化氢的发光反应，而被测定的LH