局部应用血管内皮细胞生长因子对大鼠缺血皮瓣存活能力影响.docVIP

局部应用血管内皮细胞生长因子对大鼠缺血皮瓣存活能力影响 　　【摘要】 目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)对大鼠缺血皮瓣存活能力的影响。探讨其作用机制和局部更有效的给药途径。方法 将45只SD大鼠，随机分为A、B、C三组,每组15只。于背部作6 cm×1.5 cm蒂位于双侧髂棘连线上的全层缺血皮瓣。A组在皮瓣下注射生理盐水，B组皮瓣下注射VEGF生理盐水溶液,C组皮瓣下放置含VEGF生理盐水溶液明胶海绵,原位缝合皮瓣。术后第3，7，14 d观察缺血皮瓣的成活面积,并进行组织学观察，用RT?PCR方法检测皮瓣中VEGFmRNA 的含量。结果 14天时，C组皮瓣的成活面积率明显高于B组(P 　　【关键词】 大鼠；血管内皮细胞生长因子；缺血皮瓣；明胶海绵；成活率 　　文章编号：1003-1383(2007)02-0115-03 　　中图分类号：R 622+.1 文献标识码：A 　　皮瓣的成活在修复与重建外科领域是一个很关键的问题。尤其是提高缺血皮瓣的成活能力更是研究的重点。引起皮瓣坏死的主要原因是皮瓣血流动力学的改变，动脉血供不足，静脉排流不畅，或者是二种情况同时存在。而血管内皮细胞生长因子（VEGF）通过与存在于血管内皮上的其受体特异性结合，刺激血管形成，同时在促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生方面起着十分重要的作用。本实验通过建立大鼠背部缺血皮瓣模型（蒂∶长度＝4∶1），主要通过RT?PCR方法来观察以不同方式给予外源性VEGF后，对皮瓣成活能力的影响。 　　 　　材料和方法 　　1.材料 试验动物：选健康SD大鼠，体重250～280 g，雌雄不限、由锦州医学院实验动物中心提供。VEGF购自美国RD Systems公司。VEGFmRNA RT?PCR试剂盒购于上海生工生物工程技术服务有限公司。 　　作者简介：王继红(1973-)，女，辽宁省锦州市人，主治医师，医学硕士。 　　2.造模 将45只大鼠随机分为A、B、C三组，每组15只。腹腔内注射氯胺酮100 mg/kg麻醉，无菌条件下，于背部作6 cm×1.5 cm［1］蒂部位于双侧髂棘连线上的全层皮瓣，皮瓣内包括背部肉膜层,在背部肌膜的浅面进行解剖。用无菌生理盐水将VEGF配成10 ng/100 μl的工作液。术中皮瓣形成后，各组分别给予下述处理：①A组：于皮瓣双侧缘的2 cm、4 cm处, 及最远端中心点的供区及受区5对共10个位点，每位点皮下注射100 μl生理盐水，每瓣共1 ml。②B组：同A组的10个位点每一位点注射VEGF工作液100 μl,每瓣共1 ml,含VEGF100 ng。③C组：将6 cm×1.5 cm明胶海绵先敷于创面上，待其湿润后同A组的5对位点将100 ng 的VEGF溶液注入到明胶海绵上。 用1号丝线间断原位缝合皮瓣。 　　3.检测指标 ①外科观察：观察愈合过程中皮瓣的颜色、质地、组织水肿、坏死、炎症情况。术后每日定时观察并记录。②瓣成活率检测：于术后3天、7天和14天，用硫酸纸准确描绘各组皮瓣的形态,坏死区域用墨汁涂黑，数码照相，用图象分析软件PHOTO SHOP予以分析。皮瓣成活率=(原始皮瓣面积－坏死皮瓣面积)/原始皮瓣面积×100%。③组织学观察：分别于第3 d、7 d、14 d，每组处死5只动物。取皮瓣中远段(5 cm)处0.5 cm×1.0 cm组织块，置40 g/L中性福尔马林溶液中固定后，石蜡定向包埋,连续切片，片厚5 μm，行HE染色后用普通光镜观察。 　　4.VEGFmRNA的检测 分别于术后3、7、14 d，切取三组大鼠相同部位的有活力的皮瓣组织，取材后快速放入液氮中冷冻。组织彻底冻透后放入-90℃冰箱里保存。 RT?PCR的检测步骤为：①总RNA提取；②按逆转录试剂盒说明操作进行逆转录反应；③PCR扩增。PCR反应参数：94℃预变性4 min。然后，94℃ 50 s、53℃ 50 s、72℃ 50 s，共35个循环，最后延伸7 min，得到反应产物。VEGF正义引物序列为：5’?TGC ACC CAC GAC AGA AGG GGA?3’,反义引物序列为5’?TCA CCG CCT TGG CTT GTC ACA T?3’，扩增产物的片段为：VEGF121-360 bp,β?actin正义引物序列为：5’?GGT GGG TAT GGG TCA GAA?3’；反义引物序列为5’?TGC ATC CTG TCA GCG ATG?3’,扩增产物的片段为801 bp。引物由上海生工生物技术工程有限公司合成。取10 μl PCR产物上样，20 g/L琼脂糖凝胶电泳。扫描电泳照片,用凝胶成像系统测定PCR产物条带灰度值，以VEGF与相应内参β?actin基因条带灰度的比值作为结果进行分析。 　　5.统计学处理