马齿苋总黄酮对大鼠血管平滑肌细胞增殖影响.docVIP

马齿苋总黄酮对大鼠血管平滑肌细胞增殖影响 　　【摘要】 目的 观察马齿苋总黄酮对大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMC)增殖的抑制作用及机制。方法 由细胞计数、MTT法测定细胞增殖率，采用羟胺法、TBA方法分别测定培养液中SOD活性、MDA含量。结果 马齿苋总黄酮（16.0、32.0、64.0 μg/ml）以浓度依赖方式抑制RASMC增殖及抑制氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）诱导RASMC增殖，可诱导少量RASMC凋亡，马齿苋总黄酮预处理24 h后已出现明显的抗增殖作用，提高培养液中SOD活性、降低MDA含量。结论 马齿苋总黄酮具有抗RASMC增殖作用，该作用与提高SOD活性、降低MDA含量有关。 　　【关键词】 马齿苋总黄酮；主动脉平滑肌细胞；细胞增殖；氧化型低密度脂蛋白；SOD；MDA 　　文章编号：1003-1383(2007)03-0237-03 　　中图分类号：R 285.5 文献标识码：A 　　动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一类严重威胁人类健康的常见病、多发病，是心脑血管疾病的重要病理基础，由AS诱发的心脑血管疾病是导致世界人口死亡的主要原因。近年来，心脑血管疾病的发病率、死亡率在我国一直呈明显上升的趋势。病理状态下，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle clls,VSMC）由收缩型转变为合成型后，迁移至内膜，大量增殖和分泌细胞外基质，由此导致血管增生重构，这是许多心血管疾病的重要病理变化［1］。研究VSMC的异常增殖机制，通过不同方式阻断其增殖途径是治疗心血管疾病的策略之一，抑制VSMC增殖是目前有效防治AS、高血压、血管再狭窄和延缓衰老的新途径。马齿苋是我国常用的传统中药，也是人们常作蔬菜食用的野菜。现代药理学研究证实，马齿苋具有抗氧化、抗血栓、降血脂［2］、增加膜脂流动性［3］，整体动物实验显示有抗AS作用［4］。马齿苋总黄酮对VSMC增殖作用的影响及其作用机制的影响，在国内外报道很少，因此，本文报道研究马齿苋总黄酮抗VSMC增殖作用及其机制，为寻找开发满意的抗VSMC增殖药物，为马齿苋用于防治AS、高血压、血管成形术后再狭窄等主要心血管疾病和延缓衰老提供科学理论依据。 　　 　　材料与方法 　　1.药品和仪器 马齿苋总黄酮（PTF）由本实验室按文献方法［5］制备,实验前用DMEM调渗透压、pH值,储存在-20℃冰箱中备用，加药时在培养基中稀释到所需浓度,使二甲基亚砜（DMSO）占培养基中的终浓度不超过1%。丙二醛（malonyldiadehyde,MDA）和超氧化物歧化酶（supuroxide 　　※基金项目：湖南省教育厅资助项目(项目编号：05C628) 　　作者简介：卢新华（1957-），男，湖南省郴州市人，高级实验师。 dismutase,SOD）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。胎牛血清（FBS）为杭州四季清生物材料有限公司产品，DMEM培养基为美国Gibco公司产品。MTT和DMSO为美国sigma公司产品。HH.CP?TW水套式二氧化碳培养箱（上海福玛实验仪器有限公司），1×70荧光倒置相差显微镜（olympus公司,日本）,C×7 Delta 生化仪（Beckmom,美国）。 　　2.实验动物 雄性Spraque?Dawley大鼠一只,8-10 W,100-150 g,由中南大学实验动物科学部提供。 　　3.大鼠主动脉的平滑肌细胞(RASMC)的原代培养、传代培养与鉴定［6］ 采用组织块种植法进行RASMC原代培养，无菌条件下取出大鼠胸动脉Hanks液洗涤,剪成25 mm×30 mm的血管段,放入10%FBS DMEM培养液(含1×10?5u?L-1青霉素,100 mg?L-1链霉素,25 mmol?L-1HEPES),剥离外膜,将动脉纵行剪开,刮去内膜,剪成1 mm3左右的组织块,移入培养瓶,于37℃孵箱静置培养。每三天更换一次培养液，待细胞生长融合出现“峰与谷”结构时,用0.05%胰蛋白酶(含0.02%EDTA?Na)消化,首次传代按1∶1,以后每隔3～5天按1∶3传代，经形态学和免疫组化鉴定为平滑肌细胞,实验用第5～10代细胞。 　　4.氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)分离提取［7］ LDL(α=1019～1060 g/ml)用序列超速离心方法分离正常人血浆获得，在0.005M Nacl，0.02%EDTA，pH7.4盐溶液中充氮透析48 h，4℃保存备用,在使用前透析48 h去除EDTA获得LDL。LDL在含10 μmmol/L,pH7.4 PBS中透析5 h，获得oxLDL，与非氧化LDL电泳速度为15∶1。 　　5.PTF对RVSMC增殖的影响 　　(1)RVSMC计数：取生长稳定80%～90%融合的VS