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重组人Ⅱ型胰蛋白酶性质及初步应用研究 　　摘　要：目的研究重组人Ⅱ型胰蛋白酶的性质及初步应用。方法用米氏方程和双倒数作图法确定米氏常数Km，Vmax值，BAEE法测定胰蛋白酶活性，将胰蛋白酶用于激活羧肽酶原B及细胞消化。结果重组人II型胰蛋白酶最适反应温度30℃，最适pH 7.6，以BAEE为底物，Km和Vmax分别为12.7μmol／和212.76μmol／min。EDTA~PMSF抑制酶活性，高于50℃条件下易失活。与牛胰蛋白酶相比，重组人胰蛋白酶对羧肽酶原B有更高的激活效率，细胞消化方面二者效果基本相同。结论温度及pH是影响酶稳定性的较大因素，重组人胰蛋白酶可替代牛胰蛋白酶用于激活羧肽酶原B和细胞消化。 　　关键词：重组人Ⅱ型胰蛋白酶；牛胰蛋白酶：性质；应用 　　中图分类号：Q55.9　文献标识码：A　文章编号：1672-979X(2010)11-0384-05 　　盐胰蛋白酶原为胰蛋白酶的前体，在胰脏合成。在Ca2+存在条件下，胰蛋白酶原可通过肠激酶或胰蛋白酶的自身激活，断开肽链N端6位赖氨酸和7位异亮氨酸残基之间的肽键，失去一段6肽，分子构象变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶可激活酶原，成为有活性的酶。商品化胰蛋白酶主要来源于猪或牛的胰腺。 　　人胰蛋白酶有I型和II型2种类型，根据等电点不同，又分为阳离子型和阴离子型。我们用基因工程方法得到了重组人阴离子型胰蛋白酶原(II型胰蛋白酶)，激活后得到高活性的人源胰蛋白酶。由于胰蛋白酶在溶液中稳定性较差，容易发生自降解，使酶活性下降。本实验研究了重组人II型胰蛋白酶的稳定性及部分性质，并初步研究了酶解激活羧肽酶B酶原及在细胞消化中的应用。 　　 　　1　材料 　　 　　1.1　试剂 　　牛胰蛋白酶(Sigma)；重组人Ⅱ型胰蛋白酶-(本实验室制备)；苯甲酸-L-精氨酸乙酯(BAEE，Sigma)：其余试剂为进口或国产分析纯。 　　 　　1.2　仪器 　　T6紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器公司)：FE20型pH计(梅特勒，托利多仪器公司)；EV265双向电泳仪(PS265-230V，Hoefer) 　　 　　2　方法 　　 　　2.1　Jm值的测定 　　以BAEE为底物，测定重组人II型胰蛋白酶和牛胰蛋白酶的米氏常数Km。底物BAEE的浓度范围为0.005-0.25mmol／L，用双倒数作图法，以底物???度的倒数值为横坐标，反应速率即活性的倒数值为纵坐标做图，与x轴交点的负倒数即为Km。 　　 　　2.2　重组人lI型胰蛋白酶的最适温度及最适pH 　　取3mL底物分别置于4，15，20，25，30，40，55，65，75℃保温1h，加入等量的重组人II型胰蛋白酶，测定酶活性。底物用不同pn的20 mmol／L乙酸钠一乙酸，Tris-HCl及GIy-NaOH缓冲液配制。测定重组人II型胰蛋白酶活性，确定最适pH。 　　 　　2.3　重组人ll型胰蛋白酶与牛胰蛋白酶热稳定性和pH稳定性 　　将重组人Ⅱ型胰蛋白酶与牛胰蛋白酶分别配制成0.5 mg／mL溶液，分别于-20，4，15，37，50℃保温，测定不同保温时间的活性，计算失活百分比。 　　将重组人Ⅱ型胰蛋白酶1mL分别加入不同pH的缓冲液中，配成200 U／mL(0.3 mg／mL)溶液。缓冲液分别用50 mmol／L乙酸钠-乙酸，Tris-HCl和Gly-NaOH，pH2+，Mg2+，Ba2+，Mn2+，Ca2+，Fe2+，Cu2+)1 mmol／L，4℃保温1h后测活性。重组人II型胰蛋白酶液(活性750 U／mE)分别按1％的量加入EDTA(乙二胺四乙酸)，PMSF(苯甲基磺酰氟)，DTT(二巯基苏糖醇)，SDS(十二烷基硫酸钠)，Triton x，100，4℃保温1 h后测活性。另取牛胰蛋白酶粉末按上述方法配成相同活性溶液。 　　取重组人II型胰蛋白酶分别加入不同浓度(0.5，1mol／L)氯化钠溶液及尿素(1.2 mol／L)溶液配制成活性为1200 U／mL溶液。4℃放置24h后测活性。另取牛胰蛋白酶粉末配成相同活性溶液，同法操作。 　　2.5　重组人II型胰蛋白酶酶解羧肽酶B动力学研究 　　取牛胰蛋白酶和实验室制取的重组人II型胰蛋白酶，按蛋白浓度比1:50将等量的2种酶加入羧肽酶B复性液(0.5mg／mL)中。间隔一定时间测羧肽酶B活’性，并留取样品检测SDS。 　　 　　2.6　重组人ll型胰蛋白酶消化细胞的初步研究 　　细胞消化液组成：胰酶0.5 mg／mL，EDTA 0.04 g／mE溶于PBS液中，并用盐酸调为pH 7.4。所用溶液均经高温灭菌，或者经0.22岫1滤膜过滤。 　　A组为牛胰蛋白酶组，AI：800 U／mL牛胰蛋白酶酶