zj基因工程第3章(载体)PPT.ppt

;第三章 基因工程载体;基因工程载体;第一节 载体概述;1 什么是载体？;3 载体应具备的条件;④载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。 ⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。 ⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。 ⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。 ⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。 ;;4 载体的分类;第二节 质 粒 载 体;质粒(plasmid );1 质粒的生物学特征 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子 质粒常见于原核细菌和真菌中 绝大多数的质粒是DNA型的 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA 质粒DNA的分子量范围：1-300kb;1 质粒的生物学特征 质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒1-3拷贝 stringent plasmid 松弛型复制控制的质粒10-200拷贝 Stringent plasmid;质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制——质粒DNA复 制启动控制;质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制——质粒DNA复制启动控制;质粒的可转移性 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员 ;携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子等 有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具 有重要意义;1 质粒的生物学特征;质粒的不相容性：分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自??的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。;2 理想质粒载体的必备条件;质粒载体;3 质粒载体的构建;③构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆子的标记基因。 ④构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能小。 ⑤根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”(小DNA分子片段)，构建成不同的质粒克隆载体。 ;3 质粒载体的构建;普通型载体pBR322的结构图;质粒载体设计和构建遵循的原则;4 常用的质粒载体类型;;质粒载体; pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上适合的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。 许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。 ;有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。 此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。;; 操纵子;;;;;;476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5’-序列，表达半乳糖苷酶的α片段。 LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。 lacZ之内是M13的多功能连接器。;三个显著特点： （1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。 （2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用?-互补原理进行蓝白筛选。 （3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。 其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。;T载体;4 常用的质粒载体类型;强启动子的构建;开始转录;RNA转录起始; TATA盒;RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合 ;TA