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药渣纤维素降解菌筛选及酶活测定 　　摘要：以药渣和羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为碳源，通过平板初筛及多种酶活综合测定复筛，从深层封土、牛粪堆肥等样品中筛选到８株纤维素降解菌，其中菌株ＪＸ９的酶活最高，酶系组成最合理，其Ｃｘ、Ｃｂ、Ｃ１和ＦＰＡ分别达到８２．４１、5.71、15.52和7.64 Ｕ／ｍＬ。 　　关键词：药渣；纤维素降解菌；筛选；纤维素酶 　　中图分类号：Ｑ９３－３３１；Ｑ９４６．５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）04－0689-03 　　江西省现有中成药生产企业近百家，这些企业每年产生近１００万ｔ废弃中药渣，而全国每年产生１ ０００多万ｔ中药残渣［１］。药渣造成大量环境污染的同时也增加了企业处理这些药渣的经济负担，如何有效处理这些药渣的问题已日益突出［２］。药渣主要组分包括纤维素、半纤维素和木质素，其中纤维素是制约药渣降解的重要因素。使用传统的物理化学方法，如酸处理、碱处理以及蒸汽加热等方法处理药渣等，存在反应条件剧烈、设备昂贵、成本较高、带来新的环境污染等问题［１－３］。而利用投加纤维素高效降解菌的方法经济、有效，正逐渐成为当前的研究热点［４］。近年来，国内外对于纤维素降解菌和纤维素酶的报道较多，但大部分研究集中在对秸秆的降解上，对于药渣降解的报道甚少。本研究的目的就是利用以纤维素为惟一碳源的方法从堆肥中初步筛选高效无毒的好氧纤维素降解菌，再从中复筛出较好的菌株，以便开发药渣好氧堆肥的高效微生物菌剂。 　　１材料与方法 　　１．１材料 　　１．１．１含菌样品２００９年１０月中旬，采集森林中腐化的楠木、长期堆放而腐化的松木以及腐烂的植物下表层湿润肥沃的土壤，采集长期堆放药渣被污染的表层肥沃的土壤以及深层封土、牛粪堆肥等共１０份样品。这１０份样品包括植物样品４份、土壤样品６份。采集样品后立即带回实验室接种，进行富集培养。 　　１．１．２培养基［５］富集培养基：Ｋ２ＨＰＯ４ ２．０ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．４ ｇ，ＭｇＳＯ４?７Ｈ２Ｏ ０．３ ｇ，ＣａＣｌ２ ０．３ ｇ，ＦｅＳＯ４?７Ｈ２Ｏ ５．０ ｍｇ???ＭｎＳＯ４?Ｈ２Ｏ １．６ ｍｇ，ＺｎＳＯ４ １．７ ｍｇ，ＣｏＣｌ２ ２．０ ｍｇ，药渣粉３０ ｇ，用去离子水定容至１ Ｌ。羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ-Na）固体培养基：ＣＭＣ－Ｎａ １５．０ ｇ，ＮＨ４ＮＯ３ １．０ ｇ，ＭｇＳＯ４?７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ ｇ，琼脂２０ ｇ，用去离子水定容至１ Ｌ，ｐＨ自然，１２１ ℃灭菌。纤维素－刚果红固体培养基：ＫＨ２ＰＯ４ ２ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．５ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １ ｇ，琼脂２０ ｇ，刚果红０．２ ｇ，ＣＭＣ－Ｎａ ２０ ｇ，ＮａＣｌ ０．５ ｇ，用去离子水定容至１ Ｌ，ｐＨ自然，１２１℃灭菌。液体产酶培养基：ＣＭＣ－Ｎａ或者药渣２６ ｇ，ＮＨ４ＮＯ３ １．０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．５ ｇ，蛋白胨１ ｇ，酵母膏１ ｇ，ｐＨ ７．０～７．５，１２１ ℃灭菌。 　　１．２方法 　　１．２．１菌种富集称取菌种来源样品５ ｇ，加入以药渣为惟一碳源的１００ ｍＬ富集培养基中，２８ ℃恒温振荡培养７ ｄ，吸取５ ｍＬ培养液转入新的富集培养基，富集３代。 　　１．２．２菌种初筛取富集３代的培养液适当稀释，在纤维素-刚果红固体培养基上分离纯化菌种，观察平皿上是否出现水解环以及水解环的大小。同时参考水解环产生的先后和清晰度，初步比较不同菌株的纤维素酶酶活，并确定用于酶活测定的菌株。 　　１．２．３菌种复筛将分离得到的优势菌株分别接入液体产酶培养基，３７ ℃振荡培养４ ｄ，将发酵液用2层纱布过滤，滤液于４ ℃，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，上清液即为粗酶液。 　　１．２．４酶活测定［６，７］采用ＤＮＳ还原糖法测定各纤维素酶酶活。全酶活（ＦＰＡ）的测定：取2支２５ ｍＬ刻度的试管，各加０．２ ｍＬ酶液，再加ｐＨ ４．８的醋酸缓冲液１．８ ｍＬ。测定管加入１ ｃｍ × ６ ｃｍ滤纸条，充分浸泡于（５０.0±０．５）℃恒温水浴６０ ｍｉｎ，空白管同时置（５０.0±０．５）℃恒温水浴６０ ｍｉｎ。然后分别加入ＤＮＳ显色液２ ｍＬ，空白管同时加１ ｃｍ × ６ ｃｍ滤纸条。沸水浴１０ ｍｉｎ，冷却后加水至１５ ｍＬ，以空白管调零点，在５５０ ｎｍ处测ＯＤ值。内切酶酶活（Ｃｘ）的测定：取2支２５ ｍＬ刻度的试管，各加０．２ ｍＬ酶液。测定管加１．８ ｍＬ ＣＭＣ-Na（质量分数１％），空白管只加ｐＨ ４．８的醋酸缓冲液１．８ ｍＬ。然后置（５０.0±０．５）℃恒温水浴６０ ｍｉｎ。再分别加入ＤＮＳ显色液２ ｍＬ。放沸水浴锅反应１０ ｍｉｎ，冷却后加水至１５ ｍＬ，以空白管调零点，在５