生物分离-细胞破碎PPT.ppt

细胞破碎 《生化分离工程》 胞内产物：胞内酶、大部分重组蛋白等。 细胞破碎：破坏细胞壁或细胞膜 一、细胞壁的结构和化学组成 1.细菌的细胞壁 15~50nm 40~90%肽聚糖 1.5~2nm 8~10nm 2.酵母的细胞壁 由葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质构成，比G+更难破碎。 其他真菌细胞壁：主要由多糖组成(几丁质、纤维素…) 酵母细胞壁结构示意图 M——甘露聚糖；P——磷酸二酯碱；G——葡聚糖 酵母细胞 3.植物细胞和动物细胞 植物细胞：纤维素 动物细胞：无细胞壁 原核和真核细胞膜：脂质和蛋白构成 1、高压匀浆法 高压匀浆器针型阀结构简图 高压匀浆器各种阀型设计 50~70MPa 450m/s 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞悬液，常采用多次循环的操作方法。其破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率符合下式，破碎的动力学方程可表示为： （3） 式中 R——细胞破碎率 K——与温度等有关的破碎常数 N——悬浮液通过匀浆器的次数 P——操作压力 a——与微生物种类有关的常数。 高压匀浆法适合于酵母和细菌的大规模破碎 不适于团状或丝状菌破碎 2. 珠磨法 玻璃(2.5g/mL) 氧化锆(6.0g/mL) 粒径(0.1~1.0mm) 填充率(80~85%) ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机 S 破碎率； t为破碎操作时间或平均停留时间; k破碎速度常数，与搅拌转速、料液的循环流速、细胞悬浮液的浓度、玻璃小珠直径以及温度等操作因素相关 微珠直径:目标细胞直径 30～100 细菌浓度 60~120g/L 酵母浓度 140~180g/L 优点： 容易操作，破碎率可控制，易放大； 实验室和工业规模均可用； 绝大多数微生物细胞均适用 缺点： 产生大量热能，能量利用率仅1%； 影响破碎率的操作参数较多，操作过程优化较复杂 搅拌设计要能够给予研磨剂以最佳推动力，一般设计为搅拌盘。搅拌盘与驱动轴有同心的，也有偏心的；有垂直的，也有倾斜的。有的搅拌盘上有凹槽或是开度口以帮助搅拌。 珠磨机搅拌盘设计图 珠磨机搅拌盘与驱动轴方位示意图 3、超声波破碎 空穴作用： 在超声作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大、闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎 优点： 适合于多种细胞的破碎 处理少量样品操作方便，液体损失少，破碎率高 钛合金 缺点： 有效能量的利用率低，产热大，需控温（冰水或通冷却剂）； 不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎； 影响因素多，细胞种类、浓度、超声波的声频等 4.低渗裂解（渗透压冲击） 高渗溶液（如20%蔗糖、高浓度盐或甘油）中转到冷水中 适合细胞壁脆弱的细胞（动物细胞、革兰氏阴性菌）。 可分离细胞间质蛋白 5. 冻融 急冻后室温缓慢融化，反复多次 破坏细胞膜的疏水键，增加其亲水性和通透性； 胞内结晶引起细胞内外浓度变化，细胞膨胀破裂。 破碎率低 其他物理方法：研磨（细菌、植物细胞） 旋刀式匀浆（大多数动植物组织） 化学方法 1. 酸碱处理 破坏细胞壁和细胞膜，适用于酸碱稳定的产品 如：细菌L-天门冬酰胺酶的提取，将菌体悬浮在pH11~12.5的碱溶液中，振荡20min即可。 2. 有机溶剂处理 甲苯、丙酮等 溶解脂类物质，增加细胞壁和细胞膜通透性，可实现选择性释放。 3. 表面活性剂处理 十二烷基硫酸钠SDS、Triton X-100等 溶解脂蛋白和脂类，作用细胞壁和细胞膜，增加通透性 动物细胞完全破碎 有机溶剂和表面活性剂处理特点： 胞内产物总释放率低，核酸留在胞内，料液黏度低，避免大量细胞碎片，有利于后处理 破碎率低，加入试剂会形成新的污染 生物方法 1. 酶法 革兰氏阳性菌: 溶菌酶(水解肽聚糖层)； 革兰氏阴性菌： 溶菌酶＋EDTA 二价阳离子特别是Mg2＋对细胞壁外层具有稳定作用 酵母：溶壁酶(Zymolyase)、葡聚糖酶、甘露糖酶等； 植物细胞：纤维素酶 特点：操作条件温和，产物破坏小，费用高 肽聚糖 溶菌酶(lysozyme): 作用于NAM的G1和NAG的C1-C4